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\begin{document}
\Preambolo{\renewcommand{\frontsubtitlefont}{%
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\begin{frontespizio}
\Universita{Milano}
\Logo[1.5cm]{logo.jpg}

%Solo Uno tra facoltà e dipartimento!
\Facolta{Farmacia}
%\Dipartimento{Scienze Farmaceutiche ``Piero Pratesi''}

\Corso{Chimica e Tecnologia Farmaceutiche (CTF)}
\Annoaccademico{2011--2012}
\Titolo{Analisi dei Farmaci II\\A.A. 2011 -- 2012}
\Sottotitolo{Appunti dalle lezioni}
\NCandidato{Studente}
\Candidato[742303]{Dario Cambi\'{e}}
%\Candidato[741421]{Andrea Fabrizio Bassani}
\NRelatore{Docente}{}
\Relatore{Prof.\ Sergio Romeo}
\Piede {Appunti distribuiti con licenza GFDL}
\end{frontespizio}

\begin{quotation}
     Copyright \textcopyright\ 2013   Dario Cambié\\
     \\
     \`{E} garantito il permesso di copiare, distribuire e/o modificare
     questo documento seguendo i termini della Licenza per
     Documentazione Libera GNU, Versione 1.1 o ogni versione
     successiva pubblicata dalla Free Software Foundation; senza
     Sezioni Non Modificabili.  Una copia della licenza
     è acclusa nella sezione intitolata "Licenza
     per Documentazione Libera GNU".\\
     \\
     \\
     Copia di questo documento può essere scaricata all'indirizzo:\\
     \url{https://dl.dropbox.com/u/905879/static/analisi2/tecniche.pdf}\\
     Il sorgente latex è disponibile all'indirizzo:\\
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     Per segnalare errori, imprecisioni o richiedere i file necessari alla compilazione invia una mail a:
     dariocambie [AT] gmail [DOT] com
\end{quotation}
\cleardoublepage

\addcontentsline{toc}{part}{Solubilità}
\chapter{Solubilità}
\pagenumbering{arabic}
\section{Teoria}
A differenza dei gas, solidi e liquidi sono caratterizzati da significative forze d'interazione
intermolecolari.
Nel processo di dissoluzione vengono meno le forze di attrazione intermolecolare esistenti tra le
molecole della sostanza che si scioglie, tra le molecole di solvente mentre si instaurano nuove
interazioni tra molecole di solvente e soluto.
Il bilancio entalpico di questo processo è generalmente negativo (il processo, infatti, è
quasi sempre endotermico) ma è favorito termodinamicamente dal parametro entropico:
è infatti evidente l'aumento di entropia del solido che passa in soluzione.

Una approfondita conoscenza del processo di dissoluzione è cruciale in ambito farmaceutico per le sue
ricadute sull'assorbimento e quindi la biodisponibilità dei farmaci. Risulta quindi
chiara l'utilità di poter prevedere ``in silico'' la solubilità di new chemical entities \en{NCE}
durante le prime fasi di ricerca e sviluppo di un farmaco.

Come ``rule of thumb'' si può dire, in generale, che \emph{il simile scioglie il simile} (es.
solventi apolari per sostanze lipofile e polari per composti idrofili), oppure, più
propriamente ``il simile cerca il simile'' definizione che considera anche le molecole
anfipatiche come i tensioattivi dove una porzione si comporta in un modo e l'altra in un altro.
Questo perché per formare le nuove interazioni solvente-soluto serve che l'entità dei legami tra le molecole
del solvente e quelle del soluto siano simili, altrimenti si ha immiscibilità dei componenti.
Ad esempio l'olio è immiscibile in acqua a causa della molto maggiore forza che lega tra loro
le molecole di acqua (legami idrogeno) rispetto alle deboli interazioni idrofobiche dell'olio,
pertanto le molecole di olio saranno ``respinte'' da quelle di acqua e di conseguenza
formeranno una fase distinta.

\subsection{Forze di Van der Waals}
Le forza di interazione intermolecolari nel loro complesso sono spesso impropriamente
indicate come `\emph{forze di Van de Waals}, mentre più propriamente possiamo distinguere
le seguenti componenti delle forze intermolecolari:
\begin{itemize}
 \item interazioni dipolo-dipolo, ovvero le forze di \emph{Keesom} tra dipoli permanenti,
	di natura elettrostatica, possono essere attrattive o repulsive.
 \item interazioni dipolo-dipolo indotto, forze di \emph{Debye}, tra un dipolo permanente e
	il dipolo indotto in una molecola adiacente, sono dette di induzione o polarizzabilità.
 \item interazioni dipolo indotto-dipolo indotto, forze di \emph{London} o dispersive, è un'interazione
	attrattiva tra molecole o atomi non polari
 \item interazioni ione-dipolo
 \item legame ad idrogeno
 \item interazione idrofobica
\end{itemize}
Di cui le forze di Van der Waals propriamente dette sono costituite dalle sole prime tre
componenti, ovvero le più deboli. Un'interazione di VdW, infatti, è un'interazione attrattiva
tra due molecole che dipende dalla distanza internucleare con $1/r^6$\begin{comment}\footnote{Si è detto
come una componente delle interazioni di VdW siano le interazioni di Keesom, e si è anche detto
che le interazioni di VdW sono sempre attrattive mentre per Keesom possono essere attrattive (tra poli uguali)
o repulsive (tra poli opposti).
Per spiegare questa apparente contraddizione bisogna specificare che quel che si intende quando si
dice che le interazioni di Keesdom sono attrattive.
In funzione dell'orientamento spaziale delle molecole esse possono avere segno diverso,
ma il valore medio dell'interazione considerando molecole casualmente disposte è positivo.
In particolare le forze di Keesdom sono \emph{mediamente} attrattive, questo perché le distanze tra
dipoli a cui avvengono le interazioni ($1/r^6$)) sono comparabili con le distanze tra i due poli del dipolo molecolare,
ed essendo le due molecole in libera rotazione si muoveranno in modo che
sia massimizzata l'interazione attrattiva. Numericamente l'entità delle forze di Keesdom è
\begin{displaymath}
	V = - \frac{C}{r^6} \text{ dove } C = \frac{2 \mu_1^2 \cdotp \mu_2^2}{3(4\pi\epsilon_0)^2kT}
\end{displaymath}
}\end{comment}
.

\subsection{Interazioni apolari}
\label{SubSec: London}
Le molecole non polari (compresi i gas nobili) si attraggono debolmente tra loro anche
se nessuna delle due molecole che interagiscono possiede momenti di dipolo permanenti.

Ci sono molte evidenze dell'esistenza di questo tipo di interazioni, come la formazione
di fasi condensate in molecole non polari (es.\ idrogeno ed elio liquidi) o anche solo
il fatto che il benzene a temperatura ambiente sia liquido.
L'interazione tra molecole non polari\footnote{Si noti la sottile differenza tra non polare
e apolare, dove quest'ultimo è generalmente inteso come ``estremamente poco polare''} dipende
dai dipoli transienti presenti in tutte e molecole, come frutto delle fluttuazioni nelle posizioni
istantanee degli elettroni.

Queste interazioni dipolo indotto-dipolo indotto sono chiamate interazioni dispersive
o forze di London (dallo scopritore, Fritz London).

L'intensità di questa interazione (è una VdW quindi $\propto 1/r^6$) dipende dalla
polarizzabilità della prima sostanza (quella in cui si genera il momento istantaneo
di dipolo) in quanto la formazione del dipolo dipende dall'intensità con cui il nucleo
esercita controllo sugli elettroni esterni. Dipende anche dalla polarizzabilità del secondo
materiale in quanto quest'ultima indica quanto prontamente il dipolo può essere indotto
nella molecola.

Un'approssimazione delle forze di London è data da:
\begin{displaymath}
	C = \frac{3}{2}\alpha'_1 \alpha'_2 \frac{I_1 I_2}{I_1 + I_2}
\end{displaymath}
dove $I_1$ ed $I_2$ sono le energie di ionizzazione della prima e della seconda sostanza
ed $\alpha'$ i volumi di polarizzabilità (vedi la nota sulla polarizzabilità a
pagina \pageref{Nota: polarizzability}).


\subsection{Interazioni polari}
Le interazioni polari s'instaurano quando è presente almeno una sostanza polare, ovvero
una sostanza la cui densità elettronica è permanentemente squilibrata a livello molecolare, a causa
della composizione elementare della molecola e della sue geometria\footnote{Ricorda, ad
esempio, come pur presentano legami fortemente polarizzati la \ce{CO2} sia apolare
in quanto i momenti di dipolo dei due doppi legami carbonio-ossigeno si annullano essendo
uguali in intensità ed opponendosi in verso, a causa della conformazione geometrica
del carbonio}. Ad esempio acqua ed alcool etilico sono sostanze fortemente polari, il
toluene è molto debolmente polare mentre gli alcani a catena lunga sono di fatto apolari.

\subsubsection{Forze di Keesom}
\label{subsec: Keesom}
Risulta intuitivo che molecole polari tenderanno disporsi con i poli opposti vicini,
in una disposizione ``testa-coda'', aumentando l'entità delle forze intermolecolari.
Tali interazioni \emph{dipolo-dipolo} sono le \emph{forze di Keesom}.

\subsubsection{Forze di Debye}
\label{subsec: Debye}
Le forze intermolecolari tra \emph{dipolo e dipolo indotto}, invece, anche note come
\emph{forze di Debye}, si instaurano quando una molecola di per sé non polare acquisisce
un dipolo in seguito all'avvicinamento di una carica elettrostatica (il dipolo di una
molecola polare).
L'entità di tali forze dipenderà pertanto dall'intensità del dipolo della molecola polare,
dalla polarizzabilità ($\alpha$) della sostanza apolare.
Nel complesso, come per le altre interazioni di VdW, 
l'intensità è inversamente proporzionale alla sesta potenza della
distanza tra le cariche.
L'espressione completa delle forze di Debye è riportata nella formula (\ref{Eq.: Debye}).
\begin{align}
	C = \frac{\mu_1^2 \alpha'_2}{4 \pi \varepsilon_0} \label{Eq.: Debye}
\end{align}
Dove i pedici $1$ indicano il dipolo ed i $2$ il dipolo indotto, pertanto $\mu_1$ è il
momento di dipolo della molecola polare mentre $\alpha'_2$ è la polarizzabilità
della molecola in cui è indotto il dipolo\footnote{La polarizzabilità ($\alpha$ è la proprietà
degli atomi di acquisire momento magnetico quando sono sottoposti a campi elettrici.
In particolare $\alpha$ è la costante di proporzionalità tra il dipolo indotto ($\mu^*$)
ed il campo (E) applicato: $\mu^* = \alpha \cdotp E$.
\label{Nota: polarizzability}
Avendo $alpha$ u.d.m ``scomode (\si{\coulomb \squared \meter \squared \per \joule}) spesso è espressa
come ''volume di polarizzabilità`` ($\alpha'$, u.d.m. \si{\meter^3}) definito come
$\alpha' = \alpha /(4 \pi \varepsilon_0)$}. La forza di queste interazioni
è di $\approx 2-10 \si{\kilo \joule \per \mole}$.

Forze di induzione di Keesom e interazioni di Debye nel complesso sono dette interazioni polari.

\subsection{Interazioni Ioniche}
\label{SubSec: Ionic Interactions}
La interazioni ioniche si instaurano tra ioni, ovvero tra cariche elettrostatiche.
Cariche opposte si attraggono e cariche dello stesso segno si respingono, come si
evince dal segno della forza di Coulomb:
\begin{align}
	F = \frac{q_1 \cdotp q_2}{\varepsilon r^2} \label{Eq.: Coulomb}
\end{align}
Un altro parametro importante, però, è la costante dielettrica del mezzo, $\varepsilon$.

La costante dielettrica di un mezzo  è definita come il rapporto tra la capacità
di un condensatore avente tra i piatti il mezzo considerato e quella dello stesso
condensatore avente tra i propri piatti il vuoto.
\begin{displaymath}
	\varepsilon = \frac{C_x}{C_0}
\end{displaymath}

La costante dielettrica $\varepsilon$ (o permettività relativa) può essere vista come
la capacità del mezzo di separare due cariche, e pertanto è correlata con la solubilità
dei composti ionici.

La tabella mostra i valori di costante dielettrica per alcune sostanze.
\begin{table}
\begin{center}
\begin{tabular}{llll}
\hline
\multicolumn{2}{c}{\textbf{Molecole apolari}} & \multicolumn{2}{c}{\textbf{Molecole polari}} \\
\hline
Metano			& 1,655 & Acqua		& 80,10\\
Tetraclorometano	& 2,238 & Ammoniaca	& 16,9\\
Cicloesano		& 2,024 & Metanolo	& 33,0\\
Benzene			& 2,283 & Etanolo	& 25,3\\
\end{tabular}
\end{center}
\caption{Costanti dielettriche a 293\kelvin, tranne che per metano ($-173\celsius$) ed ammoniaca ($298 \kelvin$).
Fonte: HCP - Handbook of chemistry and physics, CRC Press (2000).}
\end{table} 


\subsection{Legame ad idrogeno}
\label{SubSec: H-Bond}
A differenza delle interazioni polari e delle interazioni dipolo indotto-dipolo indotto,
che sono presenti nelle molecole indipendentemente dalla loro struttura, il legame ad idrogeno
dipende dalla costituzione molecolare.

Il legame ad idrogeno è un'interazione attrattiva tra due specie, che insorge dal collegamento
tra $A-H \cdots B$, dove A e B sono elementi altamente elettronegativi e B possiede almeno un
doppietto di non legame\footnote{Nota che il legame ad idrogeno tende a disporsi linearmente.
Ciò risulta evidente se si considera che in [$A-H \cdots B$] A e B sono carichi
$\delta^-$ ed H $\delta^+$, le due cariche parziali positive, pertanto, tenderanno
a disporsi nello spazio il più lontano possibile.
Ne segue la minor stabilità (o maggio reattività) degli H-bonds angolari rispetto ai planari.}.

La forza di un legame ad idrogeno è di $\approx 20 \si{\kilo \joule \per \mole}
$.

Non c'è un limite netto per gli atomi che possono o non possono formare legami ad idrogeno
ma generalmente si assume che \ce{N}, \ce{O} ed \ce{F} siano i principali.

Nota che, se presente, il legame ad idrogeno è la più importante delle interazioni
intermolecolari.
Ricorda, infine, che si possono avere anche H-bond intramolecolari, i quali, in quanto tali,
diminuiscono l'entità delle interazioni intermolecolari, come ad es.\ nel caso dell'acido
salicilico (fig.\ \ref{Fig.:H_bond_salicilico}).
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=3cm,keepaspectratio=true]{./img/H_bond_ac_salicilico.png}
 % H_bond_ac_salicilico.png: 164x202 pixel, 96dpi, 4.34x5.34 cm, bb=0 0 123 151
 \caption{Legame idrogeno intramolecolare nell'acido salicilico.}
 \label{Fig.:H_bond_salicilico}
\end{figure}

\begin{table}
 \begin{center}
\begin{tabular}{lc}
\multicolumn{1}{c}{\textbf{Tipo interazione}} & \textbf{Valore tipico} \\
\hline
Forze dispersive di London		&  0,05 - 40 \si{\kilo \joule \per \mole}\\
Forze di Debye (dipolo-dipolo indotto)	[\ref{subsec: Debye}]&  2 - 10 \si{\kilo \joule \per \mole}\\
Interazione ione-dipolo indotto		&  3 - 15 \si{\kilo \joule \per \mole}\\
Forze di Keesom (dipolo-dipolo)		[\ref{subsec: Keesom}]&  5 - 25 \si{\kilo \joule \per \mole}\\
Legame ad idrogeno			[\ref{SubSec: H-Bond}]& 10 - 40 \si{\kilo \joule \per \mole}\\
Interazione ione-dipolo			[\ref{SubSec: Ionic Interactions}]& 40 - 600 \si{\kilo \joule \per \mole}
 \end{tabular}
 \end{center}
\caption{Riassunto delle interazioni intermolecolari e loro entità.}
\end{table} 

\section{Parametri di solubilità}
Poiché la solubilità di una sostanza in un determinato solvente dipende dalle relative
forze d'interazione intermolecolari è necessario avere un parametro che misuri
l'entità di queste interazioni per poter formulare previsioni di solubilità.
Per questo scopo viene spesso utilizzato il calore latente di vaporizzazione,
che è il calore associato alla perdita di tutte le interazioni intermolecolari 
che avviene nel passaggio tra stato liquido (dove le interazioni sono presenti) e
gassoso (dove le interazioni intermolecolari sono pressoché nulle).

Si noti che, al fine di avere informazioni sull'entità delle forze intermolecolari, non è importante
la temperatura di ebollizione ma il valore dell'entalpia (o calore) di vaporizzazione.

Dal calore di vaporizzazione ($\varDelta H_{vap}$) si può ricavare la densità di
energia coesiva ($c$), così definita:
\begin{align}
 c = \left( \frac{\varDelta H_{vap} - RT}{V_m}\right) \label{Eq.: solubilita_c}
\end{align}
Dove $R$ è la costante universale dei gas, T la temperatura in gradi $\kelvin$ e
$V_m$ il volume molare.
$\varDelta H_{vap} - RT$ è anche detta ``energia latente di vaporizzazione''.

$c$ è pertanto un parametro numerico, con grandezza calorie su $\si{cm^3}$ o $\si{\joule \per \cm^3}$.
Poiché $c$ riflette l'entità delle forze di VdW, sostanze con $c$ simile saranno miscibili tra loro.

\subsection{Parametro di solubilità di Hildebrand}
Un altro parametro impiegato per valutare l'entità delle forze di VdW è il parametro di
solubilità di Hildebrand, definito (nel 1936) come radice quadra di $c$, ovvero
\begin{align}
    \delta = \sqrt{c} = \left( \frac{\varDelta H_{vap} - RT}{V_m}\right)^{\frac{1}{2}} \label{Eq.:Hildebrand}
\end{align}
Sostanze con valori di $\delta$ simili saranno molto probabilmente miscibili.

\begin{table}[hbt]
\centering
\begin{tabular}{llll}
\multicolumn{1}{c}{\textbf{Solvente}} & \multicolumn{1}{c}{$\delta$} &
\multicolumn{1}{c}{\textbf{Solvente}} & \multicolumn{1}{c}{$\delta$} \\
\hline
Cicloesano			& 16,8	&	Cloruro di metilene	& 20,2 \\
Tetracloruro di carbonio	& 18,0	&	Piridina		& 21,7 \\
Xilene				& 18,2	&	Dimetilformammide (DMF)	& 22,1 \\
Acetato di etile		& 18,2	&	Alcol n-propilico	& 24,7 \\
Toluene				& 18,3	&	Alcool etilico		& 24,9 \\
Tetraidrofurano (THF)		& 18,5	&	Dimetilsulfossido (DMSO)& 26,2 \\
Benzene				& 18,7	&	Alcol n-butilico	& 26,4 \\
Cloroformio			& 18,7	&	Alcool metilico		& 28,7 \\
Tricloroetilene			& 18,7	&	Glicole propilenico	& 29,7 \\
Metiletilchetone		& 19,3	&	Glicole etilenico	& 30,7 \\
Acetone				& 19,7	&	Glicerina		& 34,9 \\
Dicloruro di etilene		& 20,2	&	Acqua			& 36,2
\end{tabular}
\caption{Valori del parametro di solubilità di Hildebrand $\delta$ per alcuni solventi.}
\label{Tab.:Hildebrand_solventi}
\end{table}
 Dalla tabella \ref{Tab.:Hildebrand_solventi} risulta chiara la scala dei solventi in base
alla loro ``forza``.
Nota che l'attendibilità del parametro di Hildebrand è ottima per la descrizione di
solvente apolari o debolmente polari ma non da' buoni risultati per solventi polari (momento
di dipolo $> 2$ Debye) o dove sussistano legami ad idrogeno, in quanto non sono contemplati
nella sua definizione, e pertanto non vengono considerati (cfr.\ eq.\ \ref{Eq.:Hildebrand}).

Tornando a considerare la scala dei solventi della tabella \ref{Tab.:Hildebrand_solventi},
se una sostanza è miscibile in un solvente lo sarà probabilmente anche in quelli vicini in
ordine di $\delta$, ovvero teoricamente ci sarà un gruppo continuo di solventi, nella scala
ordinata per fattore di Hildebrand, capace di solubilizzare la sostanza, a prescindere
dalle dimensioni più o meno grandi di tale gruppo.

Un vantaggio del parametro di solubilità di Hildebrand è dato dalla sua linearità,
ovvero per miscele di più solventi se ne può calcolare il valore con la media,
pesata sulle rispettive quantità relative, dei componenti.

\subsection{Parametro di solubilità di Hansen}
Come detto la descrizione di Hildebrand presenta dei problemi, non solo perché trascura il
legame ad idrogeno ma perché valori identici di $\delta$ potrebbero essere ottenuti con forze
completamente diverse e pertanto si avrebbero sostanze con lo stesso $\delta$ immiscibili.

Una descrizione più accurata è ottenuta scomponendo le componenti che formano il
parametro di solubilità di Hildebrand, ovvero dividendo $\delta$ in $\delta_D$, $\delta_P$ e $\delta_H$.
$\delta_D$ è la componente che tiene conto delle forze dispersive (D) non polari,
$\delta_P$ le forze polari (P) mentre $\delta_H$ considera il legame ad idrogeno
(ed eventuali altre componenti).
Nel complesso  $\delta_D$, $\delta_P$ e $\delta_H$ sono dette parametro di
solubilità di Hansen \en{Hansen solubility parameters, HSP}.

\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/Solubilita_solventi_grafico.png}
	% Solubilita_solventi_grafico.png: 597x516 pixel, 96dpi, 15.79x13.65 cm, bb=0 0 448 387
	\caption{Grafico di $\delta_P$ su $\delta_H$ che mostra la posizione di diverse classi di solventi.
	Le lettere indicano la serie (es. M=metil, E=etil, P=propil etc.).
	In grassetto alti valori di $\delta_D$.}
	\label{Fig.:Solubilita_hansens_grafico_solventi}
\end{figure}

In figura \ref{Fig.:Solubilita_hansens_grafico_solventi} sono riportati i valori delle componenti
dell'HSP per alcune serie di solventi.

Nota che poiché le componenti dell'HSP sono tre possono essere rappresentate in uno
spazio cartesiano tridimensionale. Per ottenere forme più simili a sfere e non dei
``dischi'' si applica una correzione ``estetica'' ovvero si moltiplica per 4 il parametro
$\delta_D$ che è quello, per sua natura, di entità generalmente minore.
Poiché questi valori
sono sperimentali e servono solo come confronto con altri l'applicazione di un fattore
di correzione come questo non provoca problemi.

La distanza tra due sostanze ($R_a$) in questo genere di rappresentazioni 3D può essere
ottenuta estraendo la radice delle differenze delle loro componenti al quadrato.
Quella che si ottiene è la lunghezza della linea che congiunge i due punti
(cfr.\ ``distanza euclidea in 3 dimensioni'' su
\href{http://en.wikipedia.org/wiki/Euclidean_distance#Three_dimensions}{Wikipedia}).
\begin{align}
	R_a &= \sqrt{4(\delta_D1 - \delta_D2)^2 + (\delta_P1 - \delta_P2)^2 + (\delta_H1 - \delta_H2)^2}
\end{align}

Oltre alla distanza tra i punti corrispondenti agli HSP di due sostanze può essere utile
il parametro RED, definito come
\begin{align}
	RED &= \frac{R_a}{R_o}
\end{align}
dove $R_o$, spesso indicato come raggio delle sfera di Hansen, è dato dal più alto
valore di $R_a$ per il quale è permessa la solubilità (o l'interazione) delle due sostanze.

Essendo $R_o$ la distanza massima nei grafici HSP 3D entro la quale avviene la solubilità
tra solvente e soluto si può immaginare di tracciare una sfera di questo raggio attorno
al punto corrispondente ad un solvente ed osservare dove si posiziona il soluto: se è
all'interno (ovvero $R_a < R_o$) si \emph{dovrebbe} avere miscibilità totale, nel caso
il punto sia nei pressi della superficie della sfera è prevista miscibilità parziale,
mentre nel caso il punto rappresentativo del solvente sia fuori dalla sfera non si avrà
miscibilità.

Quanto sopra affermato può essere riassunto così\footnote{Charles M. Hansen,
50 Years with solubility parameters—past and future; Progress in Organic Coatings 51 (2004) 77–84}:
\begin{description}
 \item[RED\ $ < 1$]	prevista miscibilità/solubilità totale;
 \item[RED\ $ \approx 1$]	prevista miscibilità/solubilità parziale;
 \item[RED\ $ > 1$]	prevista immiscibilità/insolubilità;
\end{description}

\section{Relazioni struttura--solubilità}
\subsection{Solubilità e struttura}
Per quanto riguarda le relazioni struttura--solubilità si osserva che la solubilità
di una sostanza in un soluto dipende da:
\begin{enumerate}
    \item peso molecolare della sostanza;
    \item isomeria geometrica, ad esempio nel caso di acidi $\alpha-\beta$ insaturi
    la serie cis è generalmente più solubile in acqua;
    \item isomeria strutturale, ad esempio a parità di peso molecolare alcooli più
    ramificati saranno più solubili in acqua di quelli a catena lineare;
    \item presenza/formazione di legami ad idrogeno.
\end{enumerate}

\subsection{Solubilità e pH}
Come è ovvio, la solubilità dipende dal pH. Non è il caso di dire altro.

\subsection{Solubilità e punto di fusione}
In alcune serie omologhe di sostanze c'è una relazione tra il punto di fusione della
sostanza e la solubilità in acqua, è mostrato in tabella \ref{Tab.: Xantine_solubilità}
l'esempio delle xantine.

\begin{table}
\centering
\begin{tabular}{lccc}
\textbf{Composto} & \textbf{p.f. (\celsius)} & \textbf{Sol. \ce{H2O}} & \textbf{Sol \ce{CHCl3}}\\
\hline
Proxifillina	& 135 & s.s.	& m.s.\\
Etofillina	& 161 & s.	& mod.s.\\
Caffeina	& 236 & mod. s.	& m.s.\\
Teofillina	& 274 & p.s.	& p.s.\\
Teobromina	& 350 & m.p.s.	& m.p.s.
\end{tabular}
\caption{Andamento di solubilità e punto di fusione nella xantine.}
\label{Tab.: Xantine_solubilità}
\end{table}

\subsubsection{Regular Solution Theory (RST)}
Questo comportamento è previsto dalla Regular Solution Theory (RST), sviluppata
nel secondo dopoguerra, la quale, partendo dalla definizione di soluzione reale,
quindi ricorrendo alle attività, prevedeva che:
\begin{align}
	-\log{(x_2)} &= \frac{\varDelta H_f}{2,303 RT_f} \cdotp \left( \frac{T_f - T}{T_f} \right) + \log{(\gamma_2)}
\end{align}
dove $x_2$ è la frazione molare di soluto disciolto, $\varDelta H_f$ è l'entalpia di
fusione, $T_f$ la temperatura di fusione del soluto, $\gamma$ il coefficiente di
attività ed il parametro 2,303 è necessario per la conversione da logaritmo naturale
a logaritmo decimale.

Ne segue che più bassi sono il punto di fusione del soluto ed il suo calore latente
di fusione più alta sarà la sua solubilità alla temperatura T.

\subsubsection{Approssimazione con parametro di Hildebrand}
Negli anni '70 Hildebrand e Scott hanno stimato l'entità del fattore $log{(\gamma_2)}$
ricorrendo al parametro di solubilità di Hildebrand\footnote{Ne segue che tale considerazione
è valida solo per le sostanze descritte efficacemente dal parametro di solubilità di Hildebrand
ovvero soluti non troppo polari e non elettroliti}), ottenendo la seguente relazione:
\begin{align}
	\log{\gamma_2}^{RST} = (\delta_1 - \delta_2)^2 \frac{V_2 \phi_1^2}{2,303 RT}
\end{align}
dove $\delta$ sono i parametri di solubilità di Hildebrand, $V_2$ il volume molare
del soluto (calcolato in fase liquida) e $\phi_1^2$ la frazione di volume totale occupata
dal solvente ($\approx 1$ per soluzioni diluite).

\subsubsection{General Solubility Equation (GSE)}
Nel 2000 è stata proposta da Jain e Yalkowsky un'equazione sperimentale, la General Solubility
Equation (GSE) che permette di predire con buona accuratezza la solubilità in acqua di
solidi organici non elettroliti utilizzando come parametri punto di fusione e coefficiente
di ripartizione acqua/ottanolo (logP).
Il logP può essere calcolato con appositi software (cLogP), mentre il punto di fusione
costituisce una semplice misura strumentale.

Secondo la GSE:
\begin{align}
	\log S^{solido}_{acqua} = 0,5 - 0,01 (P_f - 25) - \log P \label{Eq.: GSE}
\end{align}
dove $P_f$ è il punto di fusione espresso in gradi centigradi.

\addcontentsline{toc}{part}{Stato solido}
\chapter{Polimorfismo}
\section{Introduzione}
\definizione{Il polimorfismo è la proprietà di alcuni composti di esistere in più
di una forma cristallina.}

Il polimorfismo riveste un ruolo importante in ambito farmaceutico, in quanto diversi polimorfi
della stessa sostanza possono mostrare differenze in proprietà fisiche cruciali per
la biofarmaceutica, come solubilità e punto di fusione, o per la tecnica farmaceutica,
come densità e durezza.
Inoltre il polimorfismo può causare variazioni nella stabilità chimica e fisica.

L'esistenza di forme polimorfe viene stabilità con l'analisi cristallografica a raggi X
(cfr.\ sez.\ \ref{XRD}), o con la diffrazione dei raggi X su polveri (sez.\ \ref{XRPD}.
Questo perché strutture cristalline diverse producono spettri di diffrazione diversi.

I polimorfi esistono come prodotto di diverse celle unitarie (packing polymorphism)
o per un diverso orientamento spaziale delle molecole (polimorfismo conformazionale).

Il polimorfo più stabile è quello con l'energia libera della forma cristallina più bassa.

I polimorfi possono essere
\begin{description}
	\item[enantiotropici] se due forme polimorfiche possono convertirsi l'una nell'altra
	al di sotto della loro temperatura di fusione;

	\item[monotropici] se sono stabili durante tutto il range di temperatura al di sotto
	del punto di fusione.
\end{description}

Infine polimorfi che tendono a convertirsi in una forma più stabile sono detti metastabili.

Attualmente se sono caratterizzati più polimorfi per la stessa sostanza il brevetto e l'A.I.C.
valgono per solo una forma polimorfa, il cambio di polimorfo richiede spesso la riformulazione
della forma farmaceutica.

\subsection{Polimorfismo di packing}
\subsubsection{La resorcina}
\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=4cm,keepaspectratio=true]{./img/Resorcina.png}
	% Resorcina.png: 640x333 pixel, 72dpi, 22.58x11.75 cm, bb=0 0 640 333
	\caption{Struttura della resorcina.}
	\label{Fig.:Resorcina}
\end{figure}

La resorcina (fig.\ \ref{Fig.:Resorcina}) costituisce un esempio di ``packing polymorphism'',
in particolare presenta due (principali) polimorfi\footnote{Ci sono evidenze di una
terza forma polimorfa, $\gamma$, che si forma solo a pressioni molto elevate.}:
\begin{description}
	\item[forma $\alpha$] stabile a temperatura ambiente;
	\item[forma $\beta$] stabile a temperature (o pressioni) superiori.
\end{description}

La forma $\alpha$, meno densa, si interconverte per riscaldamento nella forma $\beta$.
Nell'interconversione (che avviene a 71-74\celsius) non c'è variazione nella simmetria
del cristallo (cella sempre ortorombica) ma solo contrazione del volume molare.
Questo perché la differenza tra le due è data principalmente dall'estesa rete di legami
ad idrogeno che stabilizzano la forma $\alpha$ molto meno presenti (o comunque meno
forti) nella forma $\beta$.

\subsection{Polimorfismo configurazionale}
\subsubsection{L'etil $\beta$-benzilaminocrotonato}
Un esempio di polimorfismo configurazionale è costituito dall'etil $\beta$-\-benzil\-amino\-crotonato,
il quale può assumere due conformazioni diverse: cis o trans (vedi figura
\ref{Fig.:Polimorfismo_configurazionale_struttura}).
\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/etil_beta_benzil_amino_crotonato.png}
	% etil_beta_benzil_amino_crotonato.png: 781x184 pixel, 96dpi, 20.66x4.87 cm, bb=0 0 586 138
	\caption{Conformeri del etil $\beta$-benzilaminocrotonato}
	\label{Fig.:Polimorfismo_configurazionale_struttura}
\end{figure}

\subsection{Polimorfismo dovuto a tautomeri}
Anche i diversi tautomeri di una molecola possono dar luogo a forme cristalline diverse,
e quindi a polimorfi.
Le strutture chimiche che possono dare luogo polimorfismo causato da tautomeri sono
quelle aventi tautomeri stabili, in figura \ref{Fig.:Polimorfismo_Tautomeri_ranitidina}
è mostrato il caso della ranitidina.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/Polimorfi_tautomeri_ranitidina.png}
 % Polimorfi_tautomeri_ranitidina.png: 515x277 pixel, 96dpi, 13.62x7.33 cm, bb=0 0 386 208
 \caption{La possibilità di tautomeria nella catena laterale della ranitidina da' origine a polimorfi dovuti a tautomeri.}
 \label{Fig.:Polimorfismo_Tautomeri_ranitidina}
\end{figure}

\subsection{Polimorfismo conformazionale}
Il polimorfismo conformazionale è dovuto alle diverse possibili rotazioni attorno
a legami semplici che possono dar luogo a celle cristalline diverse.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=5cm,keepaspectratio=true]{./img/Polimorfi_conformazionali.png}
 % Polimorfi_conformazionali.png: 204x152 pixel, 96dpi, 5.40x4.02 cm, bb=0 0 153 114
 \caption{Struttura della N-p-Cloro\-benzil\-idene)-p-cloro\-anilina.}
 \label{Fig.:Polimorfismo_conformazionale_struttura}
\end{figure}
E' il caso delle diverse possibili rotazioni attorno al legame tra carbonio imminico
e residuo aromatico nella (N-p-Cloro\-benzil\-idene)-p-cloro\-anilina dove la conformazione
planare da' luogo a cristalli triclini stabili (figura \ref{Fig.:Polimorfismo_conformazionale_stabile})
mentre la forma non planare da' cristalli ortorombici instabili(figura
\ref{Fig.:Polimorfismo_conformazionale_instabile}).

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=4cm,keepaspectratio=true]{./img/Polimorfi_conformazionali_stabile.png}
 % Polimorfi_conformazionali_stabile.png: 277x151 pixel, 96dpi, 7.33x3.99 cm, bb=0 0 208 113
 \caption{Polimorfo stabile (planare).}
 \label{Fig.:Polimorfismo_conformazionale_stabile}
\end{figure}
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=4cm,keepaspectratio=true]{./img/Polimorfi_conformazionali_instabile.png}
 \caption{Polimorfo instabile (non planare).}
 \label{Fig.:Polimorfismo_conformazionale_instabile}
\end{figure}

\subsection{Solidi amorfi}
In alternativa ad un abito cristallino una sostanza può solidificare come amorfo.

\definizione{Un solido amorfo è un solido che manca di reticolo cristallino, cioè di
ordine a lungo raggio tra le posizione reciproche degli atomi nello spazio.}

I solidi amorfi sono caratterizzati da uno stato rigido, detto vetroso, ed uno più
morbido, detto gommoso.
La transizione a cui avviene il passaggio da una forma all'altra è detta temperatura di transizione
vetrosa ($T_g$): al di sotto di tale temperatura il composto avrà comportamento vetroso,
al di sopra gommoso.

\subsection{Impatto sull'industria farmaceutica}
L'impatto del polimorfismo nell'ambito dell'industria farmaceutica è, come detto, vasto.
In particolare transizioni polimorfiche o l'esistenza di diversi polimorfi possono
influire su:
\begin{itemize}
	\item solubilità;
	\item biodisponibilità;
	\item proprietà tecnologiche;
	\item protezione brevettuale.
\end{itemize}

\esame[28/11/11]{Illustrare l'importanza del polimorfismo nella chimica farmaceutica
e le tecniche usate per la caratterizzazione dei solidi polimorfi.}
Dove tutte e quattro questi effetti possono essere d'importanza cruciale.
Ad esempio tra i sulfamidici, che sono una famiglia di farmaci caratterizzata da un'alta
frequenza del fenomeno del polimorfismo, la sulfametossidiazina presenta non meno di
$5$ diverse forme cristalline, delle quali alcune hanno velocità di dissoluzione più che
doppia rispetto ad altre.

\chapter{Punto di fusione}
\section{Punto di fusione}
Il punto di fusione è la temperatura alla quale un solido cristallino, alla pressione
di una atmosfera, è in equilibrio con la fase liquida. Poiché il passaggio di fase necessita
che vengano vinte le forze intermolecolari che tengono le molecole di solido vicine,
la temperatura a cui si verifica la fusione dipende dalla struttura delle molecole
coinvolte. Pertanto, in linea generale, composti diversi avranno punti di fusione diversi,
ed il p.f. può costituire un elemento di identificazione per composti incogniti.
Ricorda infine che, a differenza del punto di ebollizione, il punto di fusione varia
in modo del tutto trascurabile in funzione della pressione, pertanto è più che giustificato
trascurare eventuali correzioni per la pressione.

\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=4cm,keepaspectratio=true]{./img/Thiele.png}
	% Thiele.png: 244x370 pixel, 72dpi, 8.61x13.05 cm, bb=0 0 244 370
	\caption{Apparecchio Thiele (oggi in disuso) per la determinazione del p.f.}
	\label{Fig.:Thiele}
\end{figure}


Le sostanze organiche pure, non ioniche cristalline hanno un punto di fusione netto,
ovvero il passaggio da fase solida a liquida avviene in un intervallo di temperatura ristretto ($0,5 - 1\celsius$).

Le sostanze contenenti impurezze hanno un intervallo di fusione più largo, come regola
del pollice il p.f. di una sostanza contenente impurezze è più basso di quello
della sostanza pura a causa della formazione di un eutettico (cfr.\ \ref{punto fusione DSC}
a pag.\ \pageref{punto fusione DSC}). Un intervallo di fusione ampio per una sostanza
organica, non ionica e cristallina è pertanto sintomo di scarsa purezza.

L'allargamento dell'intervallo di fusione nel caso di impurezze formanti con il campione
una miscela eutettica è evidente in figura \ref{Fig.:Eutettico_pf} (cfr.\ sez.\ \ref{Eutettico})
\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/Pf_eutettico.png}
	% Pf_eutettico.png: 572x431 pixel, 96dpi, 15.13x11.40 cm, bb=0 0 429 323
	\caption{Diagramma di una miscela eutettica, sulla destra evidenziato l'intervallo di temperature fusione per una composizione arbitraria.}
	\label{Fig.:Eutettico_pf}
\end{figure}

Nota che l'abbassamento del punto di fusione da parte di miscele eutettiche può essere
sfruttato anche per l'identificazione di composti incogniti. Ad es. misurato il punto di
fusione di una sostanza incognita pura e trovando più possibili sostanze nello stesso intervallo
di temperatura si può provare ad aggiungere piccole aliquote di queste ultime e verificare se
si osservi o meno un abbassamento della temperatura di fusione. Se solo per una sostanza testata
ciò non dovesse avvenire significa che quella sostanza è la stessa del campione incognito.

\subsection{Metodi di misura}

\subsubsection{Metodo del tubo capillare}

Per temperatura di fusione col metodo del tubo capillare, si intende la
temperatura alla quale l'ultima particella solida di una colonna compatta
della sostanza passa alla fase liquida all'interno del tubicino del punto di
fusione.

La determinazione avviene quindi attraverso il cosiddetto punto di fusione
trasparente, dato che esso costituisce un criterio inequivocabile per la
determinazione del punto di fusione.

E' pratica comune, per ottimizzare il tempo, quella di eseguire inizialmente una rapida
ed approssimata determinazione del punto di fusione mediante riscaldamento rapido,
seguita da almeno due accurate determinazione (con gradienti minori, circa 2\si{\celsius \per \minute})
finché non siano ottenuti due misurazioni coerenti\footnote{La pratica del laboratorio
didattico è altra cosa...}.

Il metodo standard del tubo capillare si basa su un bagno di liquido riscaldabile,
dotato di un termometro per la misurazione della temperatura. Un tubo capillare in vetro,
contenente la sostanza da analizzare, viene introdotto nel liquido in modo tale che
la sostanza si trovi vicino al bulbo di mercurio del termometro (cfr.\ fig.\ \ref{Fig.:Thiele}).

Sebbene il metodo del tubo capillare descritto in Ph.\ Eur.\ preveda la rilevazione
visiva del punto di fusione esistono oggi apparecchi che consentono, oltre alla tradizionale
rilevazione visiva anche quella automatica, sfruttando il passaggio di luce attraverso il
campione. La luce è riflessa dal solido mentre può attraversare il liquido, azionando
dei fotodiodi.

\begin{PhEur}[Melting point -- capillary method]{2.2.14}
The melting point determined by the capillary method is the
temperature at which the last solid particle of a compact
column of a substance in a tube passes into the liquid phase.

When prescribed in the monograph, the same apparatus and
method are used for the determination of other factors, such
as meniscus formation or melting range, that characterise
the melting behaviour of a substance.
\paragraph*{Apparatus} The apparatus consists of:
\begin{itemize}
	\item a suitable glass vessel containing a liquid bath (for
example, water, liquid paraffin or silicone oil) and fitted
with a suitable means of heating;

	\item a suitable means of stirring, ensuring uniformity of
temperature within the bath;

	\item a suitable thermometer with graduation at not more than
$0.5\celsius$ intervals and provided with an immersion mark.
The range of the thermometer is not more than $100\celsius$;

	\item alkali-free hard-glass capillary tubes of internal diameter
$0.9\mm$ to $1.1\mm$ with a wall $0.10\mm$ to $0.15\mm$ thick
and sealed at one end.
\end{itemize}

\paragraph*{Method} Unless otherwise prescribed, dry the finely
powdered substance in vacuo and over anhydrous silica
gel R for $24\hour$. Introduce a sufficient quantity into a capillary
tube to give a compact column $4\mm$ to $6\mm$ in height.

Raise the temperature of the bath to about $10$\celsius\ below the
presumed melting point and then adjust the rate of heating
to about $1\si{\celsius \per \minute}$. When the temperature is $5\celsius$ below the
presumed melting point, correctly introduce the capillary
tube into the instrument. For the apparatus described above,
immerse the capillary tube so that the closed end is near the
the centre of the bulb of the thermometer, the immersion mark
of which is at the level of the surface of the liquid. Record
the temperature at which the last particle passes into the
liquid phase.

\paragraph*{Calibration of the apparatus} The apparatus may be
calibrated using melting point reference substances such as
those of the World Health Organisation or other appropriate
substances.
\end{PhEur}

\subsubsection{Metodo del tubo capillare aperto}
Il cosiddetto ``metodo del tubo capillare aperto'' o \emph{punto
di fusione ascendente} può essere utilizzato per determinazioni particolari,
es.\ sostanze che fondono rigonfiandosi. Più che un vero e proprio punto di fusione
si tratta in questi casi di un punto di rammollimento.

\begin{PhEur}
For certain substances, the following method is used to
determine the melting point (also referred to as slip point
and rising melting point when determined by this method).


Use glass capillary tubes open at both ends, about $80\mm$
long, having an external diameter of $1.4\mm$ to $1.5\mm$ and
an internal diameter of $1.0\mm$ to $1.2\mm$.
Introduce into each of $5$ capillary tubes a sufficient amount
of the substance, previously treated as described, to form
in each tube a column about $10$\mm high and allow the
tubes to stand for the appropriate time and at the prescribed
temperature.
Unless otherwise prescribed, substances with a waxy
consistency are carefully and completely melted on a
water-bath before introduction into the capillary tubes.
Allow the tubes to stand at $2-8\celsius$ for $2\hour$.
Attach one of the tubes to a thermometer graduated in $0.5\celsius$
so that the substance is close to the bulb of the thermometer.
Introduce the thermometer with the attached tube into
a beaker so that the distance between the bottom of the
beaker and the lower part of the bulb of the thermometer is
$1\cm$. Fill the beaker with water to a depth of $5\cm$. Increase
the temperature of the water gradually at a rate of $1\si{\celsius \per \minute}$.
The temperature at which the substance begins to rise in the
capillary tube is regarded as the melting point.
Repeat the operation with the other $4$ capillary tubes and
calculate the result as the mean of the $5$ readings.
\end{PhEur}

\subsubsection{Metodo della fusione istantanea}
Qualora il lento riscaldamento del campione comporti il rischio di decomposizione o di
trasformazioni polimorfiche nel campione è opportuno utilizzare il metodo della fusione
istantanea.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/pf_istantanea_blocco.png}
 % pf_istantanea_blocco.png: 317x186 pixel, 96dpi, 8.39x4.92 cm, bb=0 0 238 139
 \caption{Bloc Maquenne per fusione istantanea}
 \label{Fig.:Pf_fusione_istantanea_blocco}
\end{figure}


\begin{PhEur}[Melting Point -- Istantaneous Method]{2.2.16}
The instantaneous melting point is calculated using the
expression :
\begin{displaymath}
    P_f = \frac{t_1 + t_2}{2}
\end{displaymath}
in which $t_1$ is the first temperature and $t_2$ the second
temperature read under the conditions stated below.

\paragraph*{Apparatus} The apparatus consists of a metal block resistant to the substance
to be examined, of good heat-conducting
capacity, such as brass, with a carefully polished plane
upper surface. The block is uniformly heated throughout
its mass by means of a micro-adjustable gas heater or an
electric heating device with fine adjustment. The block
has a cylindrical cavity, wide enough to accomodate a
thermometer, which should be maintained with the mercury
column in the same position during the calibration of the
apparatus and the determination of the melting point of
the substance to be examined. The cylindrical cavity is
parallel to the upper polished surface of the block and about
$3\mm$ from it. The apparatus is calibrated using appropriate
substances of known melting point.
\paragraph*{Method} Heat the block at a suitably rapid rate to a
temperature about $10\celsius$ below the presumed melting
temperature, then adjust the heating rate to about $1\si{\celsius \per \minute}$.
At regular intervals drop a few particles of powdered and,
where appropriate, dried substance, prepared as for the
capillary tube method, onto the block in the vicinity of the
thermometer bulb, cleaning the surface after each test.
Record the temperature t1 at which the substance melts
instantaneously for the first time in contact with the metal.
Stop the heating. During cooling drop a few particles of the
substance at regular intervals on the block, cleaning the
surface after each test. Record the temperature $t_2$ at which
the substance ceases to melt instantaneously when it comes
in contact with the metal
\paragraph*{Calibration of the apparatus} The apparatus may be
calibrated using melting point reference substances such as
those of the World Health Organisation or other appropriate
substances.
\end{PhEur}

In pratica esistono due apparati per la fusione istantanea:
\begin{itemize}
    \item il Bloc Maquenne (cfr.\ figura \ref{Fig.:Pf_fusione_istantanea_blocco});
    \item il blocco riscaldante Koefler, adatto per la determinazione in serie di punti
	di fusione senza particolari esigenze di precisione nella misurazione
	(cfr.\ figura \ref{Fig.:Pf_fusione_istantanea_koefler}).
	Nel Koefler si instaura un gradiente di temperatura per cui la polvere posta
	sul blocco presenta un fronte in corrispondenza del passaggio da solido a liquido.
	La temperatura corrispondente nel punto è la temperatura di fusione.
\end{itemize}

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/pf_istantanea_koefler.png}
 % pf_istantanea_koefler.png: 420x394 pixel, 96dpi, 11.11x10.42 cm, bb=0 0 315 295
 \caption{Apparato Koefler per punto di fusione}
 \label{Fig.:Pf_fusione_istantanea_koefler}
\end{figure}

\subsection{Dipendenza del Pf dalla velocità di riscaldamento}
Come visto in Ph.Eur.\ è prescritto un gradiente di $1\si{\celsius \per \minute}$ in
corrispondenza del punto di fusione. Questo, assieme al continuo mescolamento del liquido
riscaldante, per garantire che il campione si avvicini il più possibile alla temperatura del
bagno. Tuttavia non è in genere possibile evitare che tra campione e bagno riscaldante
si instauri una differenza di temperatura, sia pur minima ($\approx 1 \celsius$).\footnote{
Questo perchè tanto minore è la differenza di temperatura tra i due tanto meno flusso di
calore si instaura dal bagno al campione, cfr.\ legge di Newton sul raffreddamento
eq. (\ref{Legge di Newton raffreddamento}) a pag.\ \pageref{Legge di Newton raffreddamento}.}

Nota che, poiché il termometro è immerso nel fluido riscaldante o nel blocco la temperatura
letta non è mai quella del campione ma quella dell'agente riscaldante: per questo è necessario
minimizzare il più possibile la differenza di temperatura tra campione e liquido/blocco.

E' sperimentalmente dimostrato che il punto di fusione dipende dal gradiente di riscaldamento.
In particolare più velocemente aumenta il riscaldamento più si alza il punto di fusione misurato
(vedi tabella \ref{Tab.:Pf_dipendenza_gradiente1}).

\begin{table}
\begin{tabular}{>{\raggedleft}p{2cm}@{,}l>{\raggedleft}p{2cm}@{,}l}
\multicolumn{2}{m{4cm}}{\centering \textbf{Velocità di riscaldamento \si{\celsius \per \minute}}} &
\multicolumn{2}{m{4cm}}{\centering\textbf{Punto di fusione rilevato \celsius\ (secondo Ph.Eur.)}}\\
\hline
0&2 & 82&5\\
0&5 & 82&8\\
1&0 & 83&3\\
2&0 & 83&6
\end{tabular}
\caption{Effetto della velocità di riscaldamento sul punto di fusione.}
\label{Tab.:Pf_dipendenza_gradiente1}
\end{table}


Ne segue che è possibile confrontare solo valori di p.f. determinati con lo stesso gradiente
di riscaldamento.

Il processo di fusione non è immediato, si tratta, per sua natura, di un processo endotermico
che richiede del tempo.
Si distinguono quindi l'inizio della fusione, quando la prima particella
di sostanza diventa liquida  ed il punto di fusione trasparente quando l'ultima particella
diventa liquida.
Durante l'intervallo tra inizio e fine della fusione il calore fornito è impiegato come $\varDelta H_f$.
Come detto secondo Ph.Eur.\ il p.f. è definito come la temperatura del bagno riscaldante
in corrispondenza del punto trasparente, in questo modo però non tiene conto dell'intervallo
di temperature esistente tra l'inizio della fusione e la fine.

La temperatura di fusione corretta è quindi ottenibile per sottrazione di un fattore di
correzione termodinamico della temperatura rilevata. In questo modo si correggono gli
effetti della velocità di riscaldamento.

\begin{comment}
\begin{table}
\begin{tabular}{>{\raggedleft}p{2cm}@{,}l>{\raggedleft}p{2cm}@{,}l}
\multicolumn{2}{m{4cm}}{\centering \textbf{Velocità di riscaldamento \si{\celsius \per \minute}}} &
\multicolumn{2}{m{4cm}}{\centering\textbf{Punto di fusione rilevato \celsius\ (secondo Ph.Eur.)}}\\
\hline
0&2 & 81&9\\
0&5 & 81&9\\
1&0 & 82&0\\
2&0 & 81&8
\end{tabular}
\caption{Punti di fusione ottenuti in seguito all'applicazione del fattore di correzione termodinamico}
\label{Tab.:Pf_dipendenza_gradiente}
\end{table}
\end{comment}

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/f_correzione_termodinamica.png}
 % f_correzione_termodinamica.png: 327x279 pixel, 96dpi, 8.65x7.38 cm, bb=0 0 245 209
 \caption{Punto di fusione e velocità di riscaldamento. Linea grigia: temperatura del campione, linea nera temperatura forno.}
 \label{Fig.:Pf_correzione_termodinamica_grafico}
\end{figure}

\paragraph*{Considerazioni preliminari}Si osservi la figura \ref{Fig.:Pf_correzione_termodinamica_grafico}.
Rappresenta l'andamento in funzione del tempo delle temperature di forno e campione durante la fusione.
La temperatura del campione a fusione ultimata è vicina a quella del forno
in quanto la differenza di temperatura (il triangolo F) che si era instaurata a causa
del calore latente fa sì che il flusso di calore sia più intenso. La temperatura misurata
al punto trasparente è quindi quella indicata in ascissa come ``rilevamento'', mentre
si cerca una correlazione tra essa e l'inizio della fusione, che da' informazioni
più riproducibili in quanto indipendenti dalla velocità di riscaldamento.
Bisogna pertanto determinare $h$, la correzione termodinamica.
$h$ dipende essenzialmente dalla pendenza della retta e da $F$, l'area del triangolo (se maggiore la temperatura rilevata
a parità di temperatura iniziale sarà maggiore) e poiché $F$ dipende dal $\varDelta H_f$ che
è una proprietà invariabile\footnote{Trascurabile, come detto, l'effetto della pressione.}
a parità di forma cristallina/polimorfo.
Il fattore di correzione termodinamica ($h$) calcolato in funzione del gradiente di riscaldamento
avrà quindi validità termodinamica nel calcolare la temperatura d'inizio fusione.

\paragraph*{Calcolo di h} Si vuole ricavare $h$, l'altezza del triangolo rettangolo,
in funzione del gradiente di riscaldamento che è la pendenza dell'ipotenusa (e quindi
il rapporto tra $h$ e $\varDelta T_f$) assumendo l'area $F$ costante.
(Per semplicità indichiamo $g$ con $\varDelta T_f$ ed il gradiente con $grad.$)
\begin{align*}
	& F = \frac{1}{2} (\varDelta T_f \cdotp h) f(\varDelta H_f) = cost. \\
	& grad. = \frac{h}{\varDelta T_f} \left(u.d.m. \, \si{\celsius \per \minute} \right) \ce{->} \varDelta T_f = \frac{h}{grad.}
\end{align*}
Sostituendo in F:
\begin{displaymath}
	F = \frac{1}{2} (\frac{h}{grad.} \cdotp h) \ce{->}  \frac{1}{2} (\frac{h^2}{grad.}) \\
\end{displaymath}
Ricavando h:
\begin{displaymath}
	h^2 = 2 \cdotp F \cdotp {grad.} \ce{->} h = \sqrt{2F}\cdotp\sqrt{grad.}\\
\end{displaymath}
Pongo  $\sqrt{2F}$ uguale a K:
\begin{displaymath}
	h = K \cdotp \sqrt{grad.}
\end{displaymath}
In realtà $K$ non dipende solo dal $\varDelta H_f$ ma anche dalla conducibilità termica
della sostanza e parametri relativi al campione ed allo strumento come la granulometria
del campione, la geometria del forno etc.
Da diversi calcoli sperimentali risulta che i valori di $1,0$ sono una buona approssimazione
di $K$ in diverse circostanze.
Per calcolare la temperatura di fusione corretta si dovrà quindi sottrarre alla temperatura
rilevata la radice quadrata del gradiente di riscaldamento, moltiplicato per $K \cong 1,0$
(cfr.\ tabella \ref{Tab.:Pf_dipendenza_gradiente2}).

\begin{table}
\begin{tabular}{>{\raggedleft}p{1.2cm}@{,}l >{\raggedleft}p{1.2cm}@{,}l >{\raggedleft}p{1.2cm}@{,}l >{\raggedleft}p{1.2cm}@{,}l}
\multicolumn{2}{m{2.4cm}}{\centering \textbf{Velocità di riscaldamento \si{\celsius \per \minute}}} &
\multicolumn{2}{m{2.4cm}}{\centering \textbf{Radice quadrata del gradiente}} &
\multicolumn{2}{m{2.4cm}}{\centering\textbf{Punto di fusione rilevato \celsius\ (secondo Ph.Eur.)}} &
\multicolumn{2}{m{2.4cm}}{\centering\textbf{Punto di fusione corretto \celsius}}\\
\hline
0&2 & 0&447 &82&5 &82&05 \\
0&5 & 0&707 &82&8 &82&09 \\
1&0 & 1&000 &83&3 &82&30 \\
2&0 & 1&414 &83&6 &82&19
\end{tabular}
\caption{Calcolo della correzione termodinamica per i punti di fusione della tabella \ref{Tab.:Pf_dipendenza_gradiente1}}
\label{Tab.:Pf_dipendenza_gradiente2}
\end{table}

\subsection[Teoria]{Teoria del punto di fusione}
\definizione{Il punto di fusione di un composto è la temperatura alla quale il suo solido
cristallino, alla pressione di un'atmosfera, è in equilibrio con il liquido.}

Tale temperatura è caratteristica per le sostanze pure e può costituire un elemento di
identificazione.

\subsubsection{Effetto della pressione}
L'effetto della pressione sulla temperatura di fusione è riassunto nell'equazione di
Clapeyron, per cui:
\begin{align}
	\frac{dP}{dT} &= \frac{\varDelta_{fus} H}{T \varDelta_{fus} V}
\end{align}
dove $P$ è la pressione, $T$ la temperatura in gradi Kelvin $V$ ed $H$ volume ed
entalpia molare.

Praticamente tutte le sostanze tranne l'acqua hanno densità del solido maggiore di quella del liquido,
pertanto all'aumento della pressione corrisponde un (lieve!) aumento della temperatura
di fusione.
Come detto per l'acqua vale la considerazione opposta.

\subsubsection{Effetto delle impurezze}
\paragraph{Tensione di Vapore}
Il punto di fusione è l'equilibrio tra la fase liquida e la fase solida.
Se osserviamo l'andamento della tensione di vapore per un composto notiamo che la curva
è ripida per la fase solida e meno pendente nella fase liquida.
Il punto in cui le due curve si incontrano (ovvero il punto di discontinuità della
derivata prima) è appunto il punto di fusione (F), come illustrato in figura
\ref{Fig.:PF_VPS}.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/pf_vps.png}
 % pf_vps.png: 325x249 pixel, 96dpi, 8.60x6.59 cm, bb=0 0 244 187
 \caption{Andamento della tensione di vapore in funzione della temperatura. Al punto F corrisponde il passaggio di fase solido-liquido.}
 \label{Fig.:PF_VPS}
\end{figure}

\paragraph{Raoult}
Per una generica impurezza ideale in fase liquida vale la legge di Raoult, per la
quale:
\begin{align}
	P_{tot} &= P_a X_a + P_b X_b
\end{align}
Assumendo che $a$ sia la sostanza d'interesse e $b$ un'impurezza presente in bassa quantità,
allora la pressione di $a$ sarà ridotta rispetto al valore teorico e sarà pari alla
pressione del composto puro per la sua frazione molare ($X_a$).

Se si sommano le considerazioni sulla dipendenza del punto di fusione dalla tensione
di vapore e l'effetto di impurezze in fase liquida sulla tensione di vapore si può
giungere alla conclusione efficacemente descritta dal grafico in figura \ref{Fig.:PF_VPS_Impurezza}.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/pf_vps_impurezza.png}
 % pf_vps_impurezza.png: 363x269 pixel, 96dpi, 9.60x7.12 cm, bb=0 0 272 202
 \caption{Previsione dell'effetto di un'impurezza sul punto di fusione secondo la legge di Raoult.}
 \label{Fig.:PF_VPS_Impurezza}
\end{figure}
Ovvero la presenza di impurezze comporterà un abbassamento del punto di fusione, e tale
abbassamento dipende in modo non-lineare (es.\ una quantità d'impurezza doppia ha un effetto
più che doppio\footnote{Questo
perché la derivata seconda del tratto di curva del vapor saturo relativa alla fase
solida è positiva, ovvero la curva è più pendente per valori più vicini ad F.})
dalla quantità d'impurezza presente.

\subsubsection{Eutettico}
\label{Eutettico}
Qualora poi, ed è cosa frequente, una determinata impurezza formi con la sostanza in
esame un composto eutettico l'abbassamento della temperatura di fusione provocato
dall'impurezza può essere anche molto marcato.

\definizione{Un eutettico, o miscela eutettica, è una miscela di sostanze il cui punto
di fusione è più basso di quello delle singole sostanze che la compongono.}

Il diagramma di fase di un generico eutettico AB composto da sostanze pure A e B
aventi punto di fusione uguale è rappresentato in figura \ref{Fig.:PF_Eutettico_diagramma}.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/PF_eutettico_diagramma_pulito.png}
 % PF_eutettico_diagramma_pulito.png: 846x531 pixel, 96dpi, 22.38x14.05 cm, bb=0 0 634 398
 \caption{Diagramma di stato di una miscela eutettica.}
 \label{Fig.:PF_Eutettico_diagramma}
\end{figure}
Si tratta di un diagramma avente in ordinata la temperatura ed in ascissa la composizione
della miscela binaria.
In questo caso ideale la composizione dell'eutettico è formata al $50\%$ da A ed al $50\%$
di B.
Il punto eutettico in senso stretto è quello di composizione eutettica, caratterizzato nel
grafico dall'avere un punto di fusione netto, ovvero dal passaggio diretto da ($\alpha + \beta$)
ad L (ovvero senza i casi $L+\alpha$ o $L+\beta$).
$\alpha$ è la fase solida del composto A, $\beta$ quella del composto B, $\alpha + \beta$
è l'eutettico.
L è il liquido (in cui i due composti si suppongono miscibili) mentre $L+\alpha$
ed $L+\beta$ indicano le fasi con contemporanea presenza del liquido e di una fase solida.

Per capire come leggere un diagramma di fase binario contenente un eutettico consideriamo
l'immagine \ref{Fig.:PF_eutettico_slide}.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/PF_eutettico_diagramma.png}
 % PF_eutettico_diagramma.png: 376x398 pixel, 96dpi, 9.95x10.53 cm, bb=0 0 282 298
 \caption{Diagramma di fase binario con eutettico.}
 \label{Fig.:PF_eutettico_slide}
\end{figure}

Ipotizziamo di partire dal punto $a_1$.
Abbiamo un liquido la cui composizione è data dall'ascissa, approssimativamente sarà
formato dallo $80\%$ di B e dal $20\%$A.
Iniziamo a raffreddarlo fino al punto $a_2$. Qui incontriamo una che rappresenta un
passaggio di stato, e infatti inizia a solidificarsi B puro.
Mentre il raffreddamento continua ($a_3$) continua a precipitare B solido.
Ciò altera la composizione del liquido che è ora più povero in B e quindi più ricco
in A. In particolare la composizione del liquido sarà pari a $b_3$.
Con un'ulteriore diminuzione della temperatura ($a_4$) si ha la fine della solidificazione
di B puro e l'inizio della solidificazione dell'eutettico. Questo perché è stata
raggiunta la temperatura di fusione dell'eutettico. Non a caso il liquido ha raggiunto
la composizione eutettica.
L'eutettico si comporta come una sostanza pure ed ha punto di fusione netto, ovvero
la temperatura non tornerà a diminuire finché tutto il liquido non si sarà solidificato.

La composizione del sistema nel complesso sarà sempre dell'$80\%$ di B e del $20\%$A,
ma ora il $40\%$ sarà sotto forma di eutettico A+B ed il $60\%$ come B puro.
Queste frazioni molari possono essere calcolate per via grafica con la regola
della leva o algebricamente.

\paragraph{Calcolo algebrico}
Poniamo che le sostanze $X$ ed $Y$ creino un eutettico $XY$ con composizione eutettica $0,27$A
e $0,73$B, e consideriamo una miscela liquida di composizione $0,50 A$ e $0,50B$.
Anche senza osservare il grafico possiamo prevedere che prima di solidificarsi come
eutettico si avrà la solidificazione come A puro in quanto la composizione di A nella
nostra miscela è maggiore della composizione dell'eutettico.
Il fattore limitante la formazione dell'eutettico è quindi $B$. Possiamo calcolare quanto
A si legherà a B nella miscela eutettica per trovare la frazione di A puro nel solido.
\begin{align}
	0,5:x &= 0,73:0,27 \\
	x &\approx 18,5\% \\
	50-x &= 31,5\%
\end{align}
Ovvero si avrà il $31,5\%$ di A puro ed il $68,5\%$ di eutettico.

\paragraph{Regola della leva}
\esame[20/6/11]{Definire l'eutettico ed illustrare un diagramma di fase binario contenente
un eutettico.}
Dal grafico \ref{Fig.:PF_eutettico_slide} si può stabilire la percentuale
di eutettico e di $B$ puro per via grafica in ogni punto e nel solido finale.
La frazione di $B$ puro solidificato alla temperatura $T$ corrispondente al punto $a_3$,
ad esempio, è data dalla lunghezza del segmento $b_3$-$a_3$ divisa per la lunghezza
del segmento che va da $b_3$ alla linea verticale destra che delimita il grafico.
La frazione di eutettico nel solido, invece, è data dalla lunghezza del segmento che
va da $a_4$ alla linea destra del grafico divisa per il segmento che va da $e$ alla
linea destra del grafico.
Il tutto può essere facilmente dimostrato matematicamente.

\subsubsection{Conglomerati}
\esame[18/1/11]{Definire un eutettico ed illustrare un diagramma di fase binario
solido-liquido di un conglomerato.}
\definizione{I conglomerati sono miscele binarie eutettiche nelle quali i due componenti
sono miscibili allo stato liquido ma immiscibili allo stato solido.}

Un sinonimo di conglomerato è ``miscela meccanica''.

\begin{quotation}
	Conviene, quando si ha a che fare con miscele, chiamare la temperatura alla
	quale il solido comincia a cristallizzare dal liquido, \emph{punto di congelamento della miscela}
	e indicare la temperatura alla quale la miscela comincia a liquefare, come \emph{punto di fusione della miscela}.
	Il diagramma di equilibrio completo generalmente include due curve, che sono dette rispettivamente
	del liquido e del solido.
	La \emph{curva del liquido} è la curva della temperatura-composizione della fase liquida,
	ed è perciò la curva dei punti di congelamento.
	La \emph{curva del solido} è la curva temperatura-composizione della miscela solida, ed
	è quindi la curva dei punti di fusione; essa corrisponde all'inizio della fusione,
	scaldando il sistema o alla fine della solidificazione, raffreddandolo.
\end{quotation}


\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/Conglomerato_diagramma.png}
 % Conglomerato_diagramma.png: 458x319 pixel, 96dpi, 12.12x8.44 cm, bb=0 0 343 239
 \caption{Diagramma di stato di un conglomerato tra naftolo e naftalina.
	Si noti la linea che divide la fase solida.}
 \label{Fig.:Diagramma conglomerato}
\end{figure}

\subsubsection{Composti solidi}
I composti solidi si formano in sistemi in cui i due componenti formano un composto
avente punto di fusione congrunente.
Si tratta di un sistema meno frequente dell'eutettico ma interessante, dato ad esempio
da miscele di benzofenone e difenilammina.

\definizione{Si dice congruente un punto di fusione capace do esistere come composto solido
in equilibrio con un liquido con la stessa composizione.}


\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=12cm,keepaspectratio=true]{./img/Composti_solidi_diagramma.png}
 % Composti_solidi_diagramma.png: 704x264 pixel, 96dpi, 18.62x6.98 cm, bb=0 0 528 198
 \caption{Diagramma di un composto solido.}
 \label{Fig.:Composti_solidi}
\end{figure}
In figura \ref{Fig.:Composti_solidi} è rappresentato il diagramma binario di un composto
solido.

Si può notare come il composto solido di composizione $A_m B_n$ provochi la formazione
di due eutettici, rispettivamente tra tra il composto stesso ed A e tra il composto e B.
La temperatura di fusione del composto può essere maggiore del p.f. di A e di B, minore
di entrambi (fig.\ \ref{Fig.:Composti_solidi}) o compresa tra le due
(fig.\ \ref{Fig.:Composti_solidi_INFN}).
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/Composti_solidi_diagrammaINFN.png}
 % Composti_solidi_diagrammaINFN.png: 687x463 pixel, 96dpi, 18.17x12.25 cm, bb=0 0 515 347
 \caption{Diagramma di stato a pressione costante di un sistema binario dotato di due punti
	eutettici (PE1, PE2) come conseguenza della formazione del composto solido di composizione C.}
 \label{Fig.:Composti_solidi_INFN}
\end{figure}
In particolare il punto di fusione del composto è indice della sua stabilità.
Se il composto non è completamente stabile, ma tende a decomporsi e dissociarsi
nei suoi componenti nello stato liquido il suo punto di fusione verrà abbassata dai
prodotti della decomposizione. La forma della parte interna della curva darà quindi
una sia pure grossolana indicazione della stabilità del composto.
Maggiore la stabilità del composto e più netto sarà il massimo, e, in genere, più larga
la parte centrale della curva come nel caso fenolo-acido picrico).
Un massimo appiattito e una curva piccola indicano una considerevole decomposizione
del composto di addizione nei suoi componenti (come nel caso naftalina e m-dinitrobenzene).


Anche miscele racemiche possono dare luogo a composti solidi, più o meno stabili
(es.\ fig.\ \ref{Fig.:Composto_solido_racemato}).
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=3cm,keepaspectratio=true]{./img/Composto_solido_racemato_mandelico.png}
 % Composto_solido_racemato_mandelico.png: 242x279 pixel, 96dpi, 6.40x7.38 cm, bb=0 0 181 209
 \caption{Composto solido formato da una miscela racemica di acido m-Fluro-\-mandelico.}
 \label{Fig.:Composto_solido_racemato}
\end{figure}

Nota che il composto solido ha proprietà diverse dai singoli enantiomeri, come si
può verificare misurando l'indice di rifrazione di un cristallo del composto solido
che risulta diverso da quello dei cristalli degli enantiomeri puri.

\subsubsection{Soluzioni solide}
Le soluzione solide sono miscele omogenee di un solido nell'altro.
Implicano il riordinamento spaziale di un solido nell'altro e per questo sono possibili
solo quando le due sostanze hanno strutture cristalline simili, costituzione chimica
analoga e volumi molecolari quasi uguali.\\
In altre parole sono estremamente rari.

Il loro diagramma di stato (Fig.\ \ref{Fig.:Soluzione solida}) è simile alle soluzioni liquide.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/soluzione_solida.png}
 % soluzione_solida.png: 348x262 pixel, 96dpi, 9.21x6.93 cm, bb=0 0 261 196
 \caption{Diagramma di fase binario per una soluzione solida.}
 \label{Fig.:Soluzione solida}
\end{figure}

\subsubsection{Diagrammi di fase dei racemati}
Un racemato è una miscela binaria di quantità uguali di due enantiomeri, e viene
talvolta indicata con (d,l) o (\textpm). I racemati cristallini possono presentarsi
in diverse forme:
\esame[21/2/11]{Illustrare le differenze tra i diagrammi di fase binari di una miscela
racemica e di un composto racemico.}
\begin{itemize}
	\item Miscele racemiche o conglomerati racemici, sono miscele meccaniche di
	cristalli delle forme ($+$) e ($-$), che possono essere risolte al microscopio.
	Questo caso si verifica quando ciascun enantiomero ha maggior affinità per le
	proprie molecole rispetto a quelle dell'altro enantiomero.
	
	\item Composti racemici, sono composti molecolari formati da cristalli nei
	quali sono presenti entrambi gli enantiomeri.
	Si formano quando le molecole di ciascun enantiomero hanno più affinità per
	l'altro enantiomero che per sé stesse.
	
	\item Pseudoracemati o soluzioni solide racemiche, si hanno quando una coppia
	di enantiomeri cristallizza insieme per formare un sistema monofasico al cui
	interno sono presenti in forma disordinata.
\end{itemize}



% +-----------------+
% | ANALISI TERMICA |
% +-----------------+

\chapter{Analisi Termica}
\section{Introduzione}
La definizione correntemente accettata di \emph{Analisi Termica} è la seguente:
\begin{quotation}
	A group of techniques in which a physical property of a substance and/or
	its reaction products is measured as a function of temperature whilst
	the substance is subjected to a controlled temperature program.\footnote{
International Confederation for Thermal Analysis (ICTA)}
\end{quotation}

L'analisi termica è un ramo della scienza dei materiali che studia le proprietà
dei materiali al variare della temperatura, la quale può fungere da variabile
dipendente o indipendente a seconda del tipo di analisi condotta.
Sono possibili diversi tipi di analisi termiche:

% TEMPERATURA
\paragraph*{}
\textbf{Temperatura come variabile indipendente}
  \begin{description}
   \item[TG]  Termo\-gravimetria			\en{Thermo\-gravimetry}
   \item[DTG] Termo\-gravimetria derivata		\en{Derivative Thermo\-gravimetry}
\\
   \item[TA]  Analisi termica			\en{Thermal Analysis}
   \item[DTA] Analisi termica differenziale	\en{Differential Thermal Analysis}
\\
   \item[DSC] Calorimetria differenziale a scansione	\en{Differential Scan\-ning Calorimetry}
  \end{description}


% CALORE
\paragraph*{}
\textbf{Temperatura come variabile dipendente}
  \begin{description}
    \item[TT]  Titolazioni termometriche		\en{Thermometric Titration}
    \item[DIE] Entalpimetria ad iniezione diretta	\en{Direct Injection Enthalpimetry}
  \end{description}


In ambito farmaceutico le analisi termiche sono molto utilizzate, ad esempio nell'identificazione
e nel controllo della purezza delle materie prime \en{raw materials}, per lo studio dei polimorfi e nella
quality assurance.

E' innanzitutto fondamentale chiarire quali fenomeni possono e quali non possono essere
studiati con analisi termiche.

Le informazioni ottenute sono relative alla struttura fisica\footnote{Possono
essere ottenute anche informazioni di carattere chimico come purezza, degradazione,
grado di cross\-link di un polimero etc.} ed alle proprietà dei materiali\footnote{In
genere sono studiate fusione, cristallizzazione, transizione vetrosa etc non per un
interesse \emph{per se} ma perché riflettono la struttura del materiale in particolari
condizioni, es.\ le trasformazioni polimorfiche al punto di fusione.}.

Alcuni vantaggi delle analisi termiche nei confronti di altri metodi analitici sono:
\begin{itemize}
	\item il campione può essere studiato in un ampio intervallo di temperature;

	\item le analisi termiche sono estremamente versatili e permettono la caratterizzazione di
	molteplici tipi diversi di campioni, anche di forme fisiche diverse;

	\item è sufficiente una piccola quantità di campione da analizzare ($0,1 \si{\micro\gram}$
	\textendash $10 \si{\milli \gram}$)

	\item sono tecniche generalmente poco costose ed \emph{operator friendly} e le analisi veloci;

	\item si può operare in atmosfera inerte o controllata.
\end{itemize}

\section{Termogravimetria (TG)}
\subsection{Principio}
I termini \emph{termogravimetria} (TG), \emph{termogravimetria differenziale} (DTG)
ed \emph{analisi termogravimetrica} (TGA) si riferiscono a metodi sperimentali dove le
variazioni di massa del campione sono utilizzate per misurare i processi chimici e, più
raramente, fisici che intervengono durante il riscaldamento della sostanza analizzata.

Mediante apposite termobilance si ottiene una misura accurata e continua della massa
in funzione della temperatura, saranno pertanto visibili tutte e sole le reazioni che
provochino una variazione della massa del campione, aumentandola o diminuendola, schematicamente:
\begin{align}
	\ce{Reagente } &\ce{-> Prodotto + ^ gas} \\
	\ce{Reagente + gas } &\ce{-> Prodotto}
\end{align}

L'intervallo di temperatura nel quale possono essere condotte
analisi TG è vasto: da $120$ a $2600\kelvin$, chiaramente con un'accuratezza variabile nell'intervallo.

La temperatura del campione può essere mantenuta costante durante lo studio di un esperimento o variata
sistematicamente in funzione del tempo o di altri parametri quali la cinetica di reazione.

Nota che la sola variazione di massa del campione non può essere utilizzata per determinare
la stechiometria di reazione ma è buona pratica confermare con analisi chimiche l'identità
del processo osservato. E' infine opportuno ricordare che non si può evidenziare da un
termogramma il passaggio di stato da solido a liquido del campione, che nonostante ciò può
essere un fattore importante nei fenomeni osservati.

\subsection{Applicazioni}
La termogravimetria ha trovato varie applicazioni (determinazione delle cinetiche di reazione etc.)
ma in ambito farmaceutico il suo utilizzo, per quanto è estensivo, è ancora oggi principalmente
concentrato sullo studio degli idrati e del contenuto di acqua\footnote{Applicazione molto
utile ed interessante dal punto di vista tecnologico-formulativo, meno dal punto di vista chimico}
\footnote{Il fatto che la TGA abbia trovato meno applicazione in chimica farmaceutica rispetto
alla chimica ``di base'' è probabilmente dovuto al fatto che in ambito chimico ``non-farmaceutico''
l'analisi termica è studiata per analizzare meccanismi e prodotti di decomposizione che si formano
a temperature molto alte, che non vengono mai raggiunte, ordinariamente, dai preparati farmaceutici.
L'unica eccezione degna di nota sono le previsioni di stabilità a lungo termine sulla base di
studi di cinetica accelerate termicamente indotte. La validità dei dati estrapolati è però
spesso esigua in quanto a temperature diverse possono essere coinvolti meccanismi di degradazione diversi.}.

Altre possibili applicazioni in ambito farmaceutico possono essere:
\begin{itemize}
	\item stabilità termica, sublimazione e meccanismi di decomposizione;
	\item caratterizzazione semplice di API ed eccipienti;
	\item analisi della cinetica di disidratazione;
	\item analisi di solventi residui.
\end{itemize}

La TG resta quindi tecnica d'elezione per lo studio dei meccanismi di disidratazione\footnote{
E' senz'altro un'analisi più semplice della Karl Fisher! L'unico rischio è finire con l'attribuire
all'acqua, anche erroneamente, la causa di ogni perdita di massa tra gli 80 ed i 100\celsius \ldots} e può
essere applicata, assieme ai dati DSC e XRD, per lo studio dell'interazione tra API ed \ce{H2O}
oppure tra eccipienti ed acqua.

Sta inoltre diventando cruciale per alcune forme farmaceutiche, quali le microsfere di poliactide (PLA),
la rimozione dei solventi organici residui, anche a livelli
molto inferiori dei limiti normativi e anche nel caso di solventi con classi di tossicità
basse, a causa della loro influenza negativa sulla stabilità della forma farmaceutica stessa\footnote{
Non a caso queste forme farmaceutiche sono in genere ottenute per spray drying.}.
In questi casi la TG può essere molto utile anche nell'ambito dello sviluppo del processo
produttivo e nel controllo di qualità.

Anche un impiego più diffuso della TG nello studio della volatilità e/o sublimazione di
API ed eccipienti, fenomeni noti ma poco indagati, potrebbe avere ricadute importanti
in ambito farmaceutico.

\subsection{Analisi quantitativa}
Oltre a considerazioni di carattere qualitativo derivabili dall'andamento generale del
termogravigramma e dalle temperature a cui si verificano le variazioni di massa è possibile
applicare la TG per analisi di tipo quantitativo, sia per l'analisi di prodotti noti sia
per la determinazione della composizione di miscele ignote di composti noti.

L'entità della variazione di massa percentuale del campione evidenziabile dal termogravigramma
per una data temperatura, infatti, è una misura assoluta della frazione di sostanza persa
o guadagnata nel fenomeno chimico o fisico verificatosi a quella temperatura, e come tale
dipende unicamente dalla quantità relative di reagenti e dalla stechiometria di reazione.

In altre parole se la massa relativa di una molecola di acqua nel rame(II) solfato pentaidrato è
del 7\%\footnote{Il valore preciso può ovviamente essere calcolato, mediante divisione,
a partire dalla masse molecolari dell'acqua e del sale: $18,015\si{\gram \per \mole} / 249,68 \approx 7,22\%$},
ed alla temperatura $T_{x1}$ si verifica la perdita di 4 molecole di acqua la diminuzione
percentuale in massa del campione rispetto alla massa iniziale $m_i$ sarà del $28\%$.

\subsection{Termobilancia}
Nella TG un campione di materiale ($1\si{\milli\gram}$ \textendash $10\si{\milli\gram}$ o più)
è posto su un braccio di una bilancia (detta \emph{termobilancia}) posta in una fornace.
Viene quindi misurata la variazione di massa del campione in funzione dell'aumento della temperatura
nella fornace.
La bilancia, infatti, è mantenuta in equilibrio da un elettromagnete alimentato da una
corrente d'intensità variabile che è incrementata non appena il braccio opposto a quello
contenente il campione ``scende'' a causa della diminuita massa del campione.
Lo spostamento del braccio è evidenziato dall'interruzione del passaggio di luce in un laser
posto appena sotto la posizione di equilibrio della bilancia e che chiude un circuito elettrico
per effetto fotoelettrico.

Questo sistema garantisce l'estrema precisione nella misurazione delle variazioni di massa.

\subsection{Termogravigramma}
Il grafico ottenuto rappresentando le variazioni di massa (in percentuale rispetto alla
massa iniziale, $m_i = 100\%$) in funzione della temperatura della fornace è detto termogramma.

\begin{figure}[ht]
	\centering
	\includegraphics[keepaspectratio=true, width=12cm]{./img/Ca_oxalate_thermogram.jpg}
	% Ca_oxalate_thermogram.jpg: 3000x1881 pixel, 72dpi, 105.83x66.36 cm, bb=0 0 3000 1881
	\caption{Termogramma del Calcio Ossalato}
	\label{Fig.:Termogravigramma Ca Ossalato}
\end{figure}

Nel termogramma riportato in figura \ref{Fig.:Termogravigramma Ca Ossalato} sono analizzati
$19,03 \si{\milli\gram}$ di calcio ossalato monoidrato ($\ce{CaC2O4} \cdotp \ce{H2O}$
$146,12 \si{\gram \per \mole}$) pari a $\approx 0,130 \si{\milli \mole}$.

Tra $125\celsius$ e $224\celsius$ il campione perde $2,28\si{\milli \gram}$, il $12,3\%$
del peso del campione, pari ad un equivalente di \ce{H2O} ($0,130 \si{\milli \mole}
\cdotp 18 \si{\gram \per \mole} \approx 2,3 \si{\milli \gram}$).

Con calcoli analoghi si può evidenziare la perdita di \ce{CO} a $\approx 520 \celsius$
e di \ce{CO2} a $\approx 780 \celsius$ che lascia il campione ridotto
a meno del 40\% della massa iniziale: rimane di fatto il solo \ce{CaO}.

\subsection{Analisi composizione}
\begin{figure}[ht]
	\centering
	\includegraphics[width=12cm,keepaspectratio=true]{./img/tga_composizione.png}
	% tga_composizione.png: 532x364 pixel, 72dpi, 18.77x12.84 cm, bb=0 0 532 364
	\caption{Analisi della composizione di un polimero mediante TG}
	\label{Fig.:TGA composizione}
\end{figure}
In figura \ref{Fig.:TGA composizione} è mostrato un esempio di applicazione della termogravimetria
per determinare la composizione di una sostanza incognita, in questo caso il polimero bianco
che costituisce una porta.

\subsection{Parametri analisi}
\paragraph*{Velocità di riscaldamento} Un parametro cruciale che influenza il grado di
definizione del termogravigramma è la velocità di riscaldamento: tanto maggiore è la
velocità con cui la fornace è riscaldata tanto maggiore sarà la differenza di temperatura tra
termocoppia e campione, e tanto meno accurata sarà l'analisi. Inoltre gradienti di
temperatura troppo aggressivi possono inficiare anche l'uniformità di temperatura all'interno
del campione, soprattutto nel caso di campioni di dimensioni troppo grandi, con conseguente
perdita nella capacità di risolvere picchi vicini.

\paragraph*{Atmosfera} Il controllo dell'atmosfera nella quale è effettuata l'analisi è importante
e può essere fondamentale per lo studio di reazioni di ossidazione. Si possono effettuare analisi TG
correntemente in atmosfera statica o dinamica, con gas inerti o sotto vuoto.
\begin{figure}[ht]
	\centering
	\includegraphics[width=12cm,keepaspectratio=true]{./img/TG_effetto_atm2.png}
	% TG_effetto_atm2.png: 469x259 pixel, 96dpi, 12.41x6.85 cm, bb=0 0 352 194
	\caption{Effetto dell'atmosfera sul termogravigramma del $\ce{CaC2O4 * H2O}$
	La linea tratteggiata è un'atmosfera di \ce{O2} quella continua \ce{N2}}
	\label{Fig.:TG effetto atm_rev_irrev}
\end{figure}

La curva in figura \ref{Fig.:TG effetto atm_rev_irrev} mostra la decomposizione dell'ossalato di calcio
monoidrato in atmosfera ossidante (\ce{O2}) ed inerte (\ce{N2}).
Si nota che la diversa atmosfera non ha effetto sulla prima perdita di peso, ed ha effetti opposti
tra secondo e terzo picco.

Il primo picco è costituito da una reazione reversibile, la disidratazione:
\begin{displaymath}
	\ce{CaC2O4 * H2O_{(s)} <=> CaC2O4_{(s)} + ^ H2O_{(g)}}
\end{displaymath}
ed il tipo di atmosfera presente non ha influenza in quanto sia l'azoto che l'ossigeno agiscono con
eguale efficacia nell'allontanare le molecole di \ce{H2O} in fase gas dall'interfaccia col solido.

Nel secondo picco, invece, si nota una temperatura più bassa della perdita di massa
nel caso dell'atmosfera con ossigeno, ciò può essere spiegato chimicamente analizzando
la reazione, irreversibile, coinvolta in questo step:
\begin{displaymath}
\begin{aligned}
	\ce{CaC2O4{(s)} -> CaCO3_{(s)} + ^ CO_{(g)}}		\qquad		&\text{(se \ce{N2})} \\
%\end{displaymath} \begin{displaymath} % again -.-``
	\ce{CaC2O4{(s)} + 1/2 O2 -> CaCO3_{(s)} + ^ CO2_{(g)}}	\qquad		&\text{(se \ce{O2})}
\end{aligned}
\end{displaymath}

Nel terzo picco, infine, si verifica un'altra reazione reversibile, la decomposizione
del carbonato di calcio a calcio ossido. Essendo una reazione reversibile (come la prima)
non si \emph{dovrebbero} osservare differenze. La distanza sperimentale tra le due linee
può essere spiegata con la differente struttura del \ce{CaCO3} formatosi nella seconda
reazione.
\begin{displaymath}
	\ce{CaCO3_{(s)} ->  CaO_{(s)} + ^ CO2_{(g)}}
\end{displaymath}

Come regola generale le reazioni reversibili non sono influenzate dal tipo di atmosfera
in cui è condotta l'analisi, con l'ovvia eccezione delle influenze dirette sulla stechiometria
di reazione o sulla legge dei gas. In altre parole, anche la reazione reversibile
\ce{CaCO3_{(s)} ->  CaO_{(s)} + ^ CO2_{(g)}} può subire importanti effetti relativi all'atmosfera
se si esegue l'analisi in un'atmosfera con significativa pressione parziale di \ce{CO2},
che è il prodotto della reazione e quindi sposta l'equilibrio, o se si esegue sotto vuoto
(fig. \ref{Fig.:TG effetto atmosfera}).
\begin{figure}[ht]
	\centering
	\includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/TG_effetto_atm.png}
	% TG_effetto_atm.png: 258x151 pixel, 96dpi, 6.83x3.99 cm, bb=0 0 193 113
	\caption{L'effetto di diverse atmosfere sul termogravigramma del \ce{CaCO3}}
	\label{Fig.:TG effetto atmosfera}
\end{figure}



\paragraph*{Riscaldamento} La fonte di calore può essere diversa, una resistenza, radiazioni IR,
microonde o altro. E' in ogni caso importante ottenere un riscaldamento uniforme del campione
ed evitare moti convettivi che possono comportare significative perdite in precisione nella
misura del peso da parte della termobilancia.

\paragraph*{Misurazione temperatura} Poiché la temperatura gioca un ruolo fondamentale
nell'analisi termogravimetrica oltre ad avere misure di massa precise è necessario anche
conoscere con precisione la temperatura del campione. Ciò può essere ottenuto mediante
termometri a resistenza di platino o con termocoppie.

\paragraph*{Quantità campione} I risultati migliori si ottengono con quantità minime di campione
da analizzare. Questo perché molte reazioni, quali quelle di decomposizione, non coinvolgono
tutta la massa del campione contemporaneamente e pertanto è richiesto un tempo maggiore
per il completamento della reazione in funzione di una massa di polvere maggiore.
Questo tempo maggiore si traduce in una minor precisione nella temperatura associata al
fenomeno in quanto il gradiente di temperatura è generalmente costante nel tempo.
\begin{figure}[ht]
	\centering
	\includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/TG_effetto_massa.png}
	% TG_effetto_massa.png: 267x323 pixel, 96dpi, 7.06x8.54 cm, bb=0 0 200 242
	\caption{Effetto della massa del campione sul termogravigramma}
	\label{Fig.:TG effetto massa campione}
\end{figure}


\section{Termogravimetria Derivata (DTG)}
La termogravimetria derivata (DTG) è un'analisi che impiega la stessa tecnica e gli
stessi principi della termogravimetria con la sola differenza che è calcolata la derivata
prima al termogravigramma.

\subsection{Perchè derivata?}
\begin{figure}[ht]
	\centering
	\includegraphics[width=12cm,keepaspectratio=true]{./img/TG_DTG.jpg}
	% TG_DTG.jpg: 1280x825 pixel, 300dpi, 10.84x6.99 cm, bb=0 0 307 198
	\caption{Calcolo della derivata (seconda curva) di una TGA}
	\label{Fig.:TG e DTG}
\end{figure}

La figura \ref{Fig.:TG e DTG} illustra, sovrapposte l'una all'altra le curve TG e DTG
di un campione.
In realtà quella tracciata, come è convenzione, è la derivata cambiata di segno, ma questo
non cambia nulla nel suo significato fisico: la derivata, infatti, aiuta semplicemente ad
individuare le temperature alle quali avvengono le variazioni di massa.

Dal punto di vista matematico la derivata può essere descritta come la pendenza punto per punto
di una curva, e come tale mantiene inalterato il dominio della funzione.
In altre parole dove nella TG avevamo una curva dove alla temperatura $T_1$ si poteva leggere
la massa del campione, nella DTG alla stessa temperatura si hanno informazioni su quanto
velocemente varia la massa del campione a quella temperatura.
In pratica i picchi in DTG corrispondono ai punti di massima pendenza delle curve di TG e
sono le temperature alle quali sono massime le variazioni di massa al campione.

La termogravimetria derivata \en{Derivative Thermogravimetry - DTG} misura la variazione di
massa rispetto al tempo o alla temperatura in funzione del tempo o della temperatura.
Matematicamente:
\begin{align}
	\frac{dm}{dt} &= f(T \text{ o } t) \\
	\frac{dm}{dT} &= f(T \text{ o } t)
\end{align}

La DTG non è altro che un'elaborazione matematica della TG, pertanto si può dire che
\begin{quotation}
	[\dots] the DTG curve presents information in a form that is more visually accessible,
	whereas the DTG curve contains no more information than does the TG curve.
\end{quotation}

\subsection{Vantaggi}
Oltre alla più immediata leggibilità la DTG presenta i seguenti vantaggi rispetto alla TG:
\begin{itemize}
	\item nella DTG l'area sotto la curva è direttamente proporzionale alla variazione di
	massa\footnote{Ciò risulta evidente se si pensa al calcolo dell'area sotto la curva come
	operazione di integrazione: l'integrale della derivata riporta alla grandezza originaria
	dei grafici TG che era la variazione di massa.};

	\item i picchi DTG corrispondono alla temperatura a cui la variazione di massa è massima,
	per quanto questo valore non abbia un significato fisico maggiore dei $T_i$ e $T_f$ della TG;

	\item l'altezza del picco DTG può essere correlato direttamente alla cinetica
	di reazione\footnote{Arrenhius $-\frac{dm}{dt} = A e^{(-E/RT)} \qquad f(m)$};

	\item l'analisi DTG permette di identificare e separare reazioni sovrapposte nello schermo TG,
	si consideri come esempio la figura \ref{Fig.:TG overlap DTG resolved};
\begin{figure}[ht]
	\centering
	\includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/DTG_overlapping_curve.png}
	% DTG overlapping curve.png: 348x287 pixel, 96dpi, 9.21x7.59 cm, bb=0 0 261 215
	\caption{Reazioni TG sovrapposte evidenziate in DTG}
	\label{Fig.:TG overlap DTG resolved}
\end{figure}

	\item grazie alla maggior sensibilità, poi, la DTG è più adatta alla generazione di ``fingerprints''
	di prodotti noti o per confrontare dei campioni con uno standard;

	\item mediante semplici estrapolazioni, poi, è possibile anche calcolare l'area di
	picchi sovrapposti, come mostrato in figura \ref{Fig.: DTG massa estrapolazione}.
\begin{figure}[ht]
	\centering
	\includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/DTG_massa_overlap.png}
	% DTG massa overlap.png: 374x286 pixel, 96dpi, 9.89x7.57 cm, bb=0 0 280 214
	\caption{Estrapolazione delle variaioni di massa delle due reazioni sovrapposte}
	\label{Fig.: DTG massa estrapolazione}
\end{figure}

\end{itemize}

\section{Analisi termica Differenziale (DTA)}
L'analisi termica differenziale è una tecnica di analisi termica nella quale la temperatura del
campione, confrontata con quella di un materiale termicamente inerte, è registrata in funzione
della temperatura del campione, del riferimento o della fornace, mentre il campione è scaldato
o raffreddato nell'intervallo di temperature che s'intende studiare.

Le variazioni di temperatura del campione rispetto al riferimento, che vengono registrate mediante
un voltmetro che collega le termocoppie poste, rispettivamente, sotto il riferimento e nel
portacampione, dipendono da trasformazioni entalpiche endotermiche o esotermiche.

\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/DTA_schema2.png}
	% DTA_schema.png: 234x179 pixel, 96dpi, 6.19x4.74 cm, bb=0 0 175 134
	\caption{Schema di funzionamento di un apparecchio per DTA}
	\label{Fig.:DTA_schema}
\end{figure}

Un apparato per DTA è schematizzato in figura \ref{Fig.:DTA_schema}. Una quantità di calore
$Q$ costante è fornita dalla fornace al sistema al campione ed al riferimento, i quali,
in assenza di fenomeni entalpici, aumentano la loro temperatura linearmente in funzione
del calore fornito, dove la costante del rapporto tra calore fornito ed aumento di temperatura
è il calore specifico.
La sostanza da analizzare potrà avere un calore specifico ($C_p$) maggiore o minore di quello
della sostanza di riferimento (in genere vetro o \ce{Al2O3}), ma poiché le due sostanze
sono poste nella medesima fornace le differenze di temperatura tenderanno a compensarsi.
Si verificherà un ``ritardo'' costante di temperatura tra quella con $C_p$ minore,
che quindi a parità di calore si scalda di più, e quella con $C_p$ maggiore.
Ovvero la curva di temperatura del campione sarà, in assenza di fenomeni entalpici,
parallela a quella del riferimento ma a temperature lievemente maggiori o inferiori
a seconda del rapporto di $C_p$ tra le due sostanze.

Le differenza di temperatura che si instaura tra riferimento e campione a causa dei diversi $_p$ è
costante in quanto avendo temperature diverse si crea un flusso di calore dalla sostanza
più calda alla più fredda, in accordo con la legge di Newton del raffreddamento, per cui

\begin{align}
	\varPhi Q &= \frac{dQ}{dt} = K (\varDelta T) \label{Legge di Newton raffreddamento}
\end{align}
dove $K$ è una costante funzione della conducibilità termica e dell'area di contatto.

Poiché quindi il flusso di calore che si instaura tra la sostanza più calda e la meno calda è
proporzionale alla differenza di temperatura e la differenza di temperatura aumenta linearmente
al tempo in funzione della differenza dei $C_p$ si giungerà ad una situazione di equilibrio
con $\varDelta T $ costante.

Il grafico delle temperature in funzione del tempo, pertanto, è una retta crescente dove, col
passare del tempo aumenta il calore fornito e quindi la temperatura. Tale retta può essere resa
lineare per evidenziare le trasformazioni a cui va incontro il campione. Fenomeni endotermici quali
fusione disidratazione e sublimazione, infatti, faranno diminuire la temperatura del
campione rispetto a quella del riferimento in quanto il calore fornito è impiegato come calore
latente della trasformazione e non è più solo correlato all'aumento di temperatura in base al $C_p$.
Analogamente le trasformazioni esotermiche provocheranno variazioni positive di temperatura,
come illustrato in figura \ref{Fig.:DTA Teoria}.

\begin{figure}[ht]
	\centering
	\includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/DTA_teoria.png}
	% DTA_teoria.png: 341x330 pixel, 96dpi, 9.02x8.73 cm, bb=0 0 256 247
	\caption{Effetto di trasformazioni endo- ed esotermiche sulle curve DTA}
	\label{Fig.:DTA Teoria}
\end{figure}

\subsection{Tipi di transizioni}
\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/DTA_transizioni.png}
	% DTA_transizioni.png: 292x237 pixel, 96dpi, 7.72x6.27 cm, bb=0 0 219 178
	\caption{Tidi di transizioni possibili in DTA}
	\label{Fig.:DTA_Transizioni}
\end{figure}
In figura \ref{Fig.:DTA_Transizioni} sono mostrati i 4 tipi di trasformazioni osservabili
in un grafico DTA:
\begin{enumerate}
	\item[I]	cambio della linea di base (es.\ transizione vetrosa);
	\item[II] 	picco endotermico (es.\ fusione);
	\item[III]	curva endotermica (es. decomposizione);
	\item[IV]	picco esotermico (es. cambio abito cristallino).
\end{enumerate}

Le transizioni II, III e IV sono dette transizioni di \emph{primo ordine}, e coinvolgono
sia calore latente sia un cambiamento di calore specifico, la transizione I è una
transizione di \emph{secondo ordine} ovvero contempla solo un cambiamento di calore
specifico\footnote{Una transizione d secondo ordine, più propriamente, è definita
come un processo nel quale la derivata della variazione di energia libera è nulla
mentre la derivata seconda non è nulla:
$(\delta^2 \varDelta G / \delta T^2) = (-\varDelta C_p / T) \neq 0 $.}.


\subsubsection{Trasformazioni endotermiche}
\label{trasformazioni_endo_eso}
Le trasformazioni endotermiche provocano
scostamenti negativi rispetto alla linea base in un grafico DTA, avvengono assorbendo calore
e sono:
\begin{itemize}
	\item fusione (passaggio solido/liquido);
	\item evaporazione (passaggio liquido/gas);
	\item sublimazione (passaggio solido/gas);
	\item disidratazione;
	\item transizioni polimorfiche.
\end{itemize}

\subsubsection{Trasformazioni esotermiche}
Le trasformazioni esotermiche provocano
scostamenti positivi rispetto alla linea base in un grafico DTA, avvengono cedendo calore
e sono:
\begin{itemize}
	\item cristallizzazione (passaggio liquido/solido);
	\item condensazione (passaggio gas/liquido);
	\item brinazione (passaggio gas/solido);
	\item adsorbimento;
	\item ossidazione;
	\item transizioni polimorfiche.
\end{itemize}

\subsubsection{Transizioni di secondo ordine}
Tra le transizioni di secondo ordine si segnala sostanzialmente la sola transizione
vetrosa, non perché sia l'unica transizione di secondo ordine esistente ma in quanto
l'unica frequentemente presente negli spettri delle analisi termiche e l'unica
d'interesse in ambito farmaceutico.

\subsubsection{Reazioni chimiche}
Non sono transizione di fase ma sono egualmente visibili in DTA a causa del $\varDelta H_{reaz.}$
le reazioni chimiche.
Possono ovviamente essere endotermiche o esotermiche a seconda dell'energia libera
di Gibbs ad esse associata.


\subsection{Teoria}
Esistono numerose teorie che tentano di spiegare e predire l'andamento dei grafici DTA.
Si può comunque dire che l'area del picco è proporzionale all'energia ceduta (se positivo) o assorbita
(se negativo) dal campione durante la trasformazione.

Una non-spiegazione approssimata può considerare il fatto che le ordinate sono proporzionali
a $\frac{dQ}{dt}$, ovvero al flusso di calore,
che è $\varPhi = \frac{dQ}{dt}$ e le ascisse corrispondono alla temperatura del riferimento,
ma poiché l'aumento di temperatura nel tempo per il riferimento è costante l'ascissa
è proporzionale al tempo, pertanto l'area di un picco è $\int \frac{dQ}{dt} dt = \varDelta Q$
ovvero l'area del picco è proporzionale all'energia ceduta (se positivo) o assorbita
(se negativo) durante la trasformazione.

Secondo la teoria più semplice (Speil modificata da Kerr e Kulp) l'area dei picchi è
\begin{align}
	A &= \int_{t1}^{t2} \varDelta T dt = \frac{m \cdotp (\varDelta H)}{gc}
\end{align}
dove $m$ è la massa del campione, $\varDelta H$ l'entalpia di reazione, $g$ una costante
dipendente dalla geometria di campione e portacampione, $c$ la conducibilità del campione.

Integrando le costanti $g$ e $c$ in $c'$ si ha: $A = c' \cdotp m (\varDelta H)$.

Si tratta di un'equazione semplice ed approssimata che trascura il gradiente di temperatura nel campione,
i parametri differenziali e che considera l'area del picco indipendente dal $C_p$ del campione.

In pratica, sebbene vi sia una correlazione tra l'integrale alla curva ed il calore
coinvolto nella trasformazione, per misura quantitative è meglio ricorrere alla più precisa DSC.

\subsection{Fattori influenzanti le curve DTA}
La DTA, essendo una tecnica a temperatura dinamica, presenta numerosi fattori che ne
influenzano le curve sperimentali. ali fattori possono essere divisi in due classi:

\setlength{\columnsep}{2mm}
\begin{center}
    \textbf{Fattori strumentali}
    \begin{multicols}{3}
	\begin{itemize}
		\item atmosfera della fornace;
		\item dimensione e forma della fornace;
		\item materiale del portacampione;
		\item geometria del portacampione;
		\item cavi e superficie di contatto delle giunzione con la termocoppia;
		\item gradiente di riscaldamento;
		\item velocità e risposta dello strumento di registrazione;
		\item posizione della termocoppia rispetto al campione.
	\end{itemize}
    \end{multicols}
\end{center}
\begin{center}
    \textbf{Caratteristiche del campione}
    \begin{multicols}{3}
	\begin{itemize}
		\item granulometria;
		\item conducibilità termica;
		\item calore specifico;
		\item impaccamento;
		\item quantità di campione;
%		\item effetto del diluente; % ?!?
		\item grado di cristallinità;
		\item rigonfiamento o restringimento del campione.
	\end{itemize}
    \end{multicols}
\end{center}

\section{Calorimetria a scansione differenziale (DSC)}
\definizione{La DSC è un'analisi termica nella quale viene misurata, in funzione della temperatura
del campione, la differenza tra i flussi termici nella sostanza ed in un riferimento,
mentre entrambi sono sottoposti ad un programma controllato di temperatura.}

Un calorimetro differenziale misura il calore fornito ad un campione relativo ad un
riferimento: l'adozione di un riferimento, infatti, consente un significativo incremento
di precisione ed accuratezza.
In un calorimetro differenziale a scansione, poi, si misura il calore necessario a
mantenere un gradiente di temperatura costante.

La DSC è la tecnica termica più utilizzata in ambito farmaceutico, e costituisce un'evoluzione
della DTA (che non ha però rimpiazzato completamente\footnote{La DTA, ad esempio, continua
ad offrire una più precisa misurazione della temperatura iniziale cui si verifica un
fenomeno termico, e resta un valido strumento per determinare se si tratta di trasformazioni endotermiche o 
esotermiche, reversibili o irreversibili e di che ordine, mentre per misurazioni quantitative
del fenomeno si ricorre alla DSC.}).

La DSC è stata introdotta a partire dagli anni '60, per superare le problematiche connesse
alla DTA.
In comune con la DTA la DSC misura la differenza di temperatura tra il campione
ed un riferimento, ma l'innovazione delle prime DSC consisteva appunto nel tentativo di tenere
pari o vicina a zero la differenza di temperatura tra i due.
In particolare si possono avere due tipi di strumenti per misurazioni DSC;
\begin{itemize}
	\item a flusso di calore (sez.\ \ref{Sez.: DSC_flusso});
	\item a compensazione di potenza (sez.\ \ref{Sez.: DSC_compensazione_potenza}).
\end{itemize}

Mentre il riferimento viene sottoposto ad un aumento lineare di temperatura il sistema di
controllo, idealmente, forza il campione a seguire lo stesso gradiente di temperatura.
Conseguentemente ogni differenza di potenza tra il piatto di riferimento e quello del campione
deve essere correlato alla capacità termica del campione ed alle entalpie associate alle sue
transizioni.
Per non dover sottrarre il contributo in calore specifico della sostanza di riferimento in
genere negli esperimenti DSC il riferimento è costituito dal portacampione vuoto.

\subsection{La DSC nell'industria farmaceutica}
In ambito farmaceutico la DSC è utilizzata diffusamente, con particolare riferimento
a tre transizioni:
\begin{itemize}
	\item[$T_g$] le transizioni vetrose, ad es.\ per determinare la presenza di amorfi e la
	temperatura di conservazione;
	\item[$C_p$] il calore specifico per verificare la validità delle procedure
	di produzione;
	\item[$T_m$] il punto di fusione per il calcolo della purezza, nell'ambito del controllo
	di qualità e per lo studio dei polimorfi che possono avere effetti sulla farmacocinetica.
\end{itemize}

\begin{quotation}
Virtually all pharmaceutical companies of substantial size will own a DSC,
whereas the majority of academic pharmaceutical departments will either own one
or have access to it.
As far as the pharmaceutical industry is concerned, the breadth
and extent of use of this instrument may vary considerably; some will only use it
as a routine screening for polymorphism whereas others will have researchers dedicated
specifically to thermal and related characterization techniques. The level of
sophistication with which the technique is used varies accordingly, with some companies
using the instrument almost entirely as a screening tool with little or no
specific data interpretation, whereas others will use the method for more advanced
predictive studies such as characterization of the glass transitions of freeze-dried
systems\footnote{D. Craig e M. Reading, Thermal Analysis of Pharmaceuticals, CRC Press.}.
\end{quotation}


\subsection{DSC a flusso di calore}
\label{Sez.: DSC_flusso}
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/DSC_flusso.png}
 % DSC_flusso.png: 600x272 pixel, 96dpi, 15.87x7.20 cm, bb=0 0 450 204
 \caption{Schema di un apparecchio DSC a flusso di calore. A = fornace,
B = crogioli campione e riferimento, C = termocoppie}
 \label{Fig.:DSC_flusso_schema}
\end{figure}

La DSC a flusso di calore è concettualmente il più semplice dei due approcci. Due crogioli,
tipicamente l'uno contenente il campione e l'altro vuoto, sono posti simmetricamente in una
fornace con una termocoppia a stretto contatto con ciascuno\footnote{In realtà per aumentare
la sensibilità in genere molte termocoppie sono collegate in serie simmetricamente nella fornace
col campione e quella di riferimento, come in figura \ref{Fig.:DSC_flusso_schema}}. Le termocoppie sono collegate
tra loro in modo che la differenza di potenziale misurata sia correlata alla differenza di
temperatura tra  due crogioli.

La differenza chiave rispetto alla DTA sta nella considerazione seguente: poiché il flusso
termico dalla fornace al crogiolo è
\begin{displaymath}
    \frac{dQ}{dt} = \frac{\varDelta T}{R}
\end{displaymath}
(dove $Q$ = calore, $t$ = tempo, $\varDelta T$ = differenza di temperatura tra fornace
e crogiolo ed $R$ = resistenza termica nel cammino del calore da fornace a crogiolo)
ne segue che la differenza di temperatura tra il crogiolo vuoto di riferimento e quello
contenente il campione riflette il flusso di calore al campione, in quanto la disposizione
simmetrica dei crogioli rispetto alla fornace garantisce l'identità del cammino del calore.

L'utilizzo di un crogiolo vuoto come riferimento interno consente di eliminare per differenza
tutte le possibili interferenze come l'assorbimento termico del crogiolo, le perdite di calore
per convezione etc.
E' necessaria la calibrazione dei segnali di $\varDelta T$ per garantire che il flusso di calore
sia funzione della temperatura, tale calibrazione è effettuata utilizzando come standard dei metalli
puri di cui sia nota l'entalpia di fusione e con materiale di capacità termica nota.

Negli strumenti a flusso di calore è generalmente la fornace a subire la programmata di
temperatura, mentre le transizioni nel campione provocano distorsioni rispetto al gradiente.
Il profilo di temperatura subito dal campione non è quindi noto a priori ma solo in seguito
all'esperimento (con l'estrapolazione dei dati) ma in ogni caso queste deviazioni dal
gradiente programmato sono minime e non presentano alcuna criticità.

\subsection{DSC a compensazione di potenza}
\label{Sez.: DSC_compensazione_potenza}
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/DSC_compensazione.png}
 % DSC_compensazione.png: 315x205 pixel, 96dpi, 8.33x5.42 cm, bb=0 0 236 154
 \caption{Schema di un apparecchio DSC a compensazione di potenza. A = fornaci,
B = crogioli campione e riferimento, C = termometri a resistenza in platino}
 \label{Fig.:DSC_compensazione_schema}
\end{figure}

Lo schema di una DSC a compensazione di potenza è riportato in figura \ref{Fig.:DSC_compensazione_schema}.
La prima differenza rispetto all'apparecchio a flusso di calore è che questo approccio
utilizza due distinte fornaci: una per il campione, l'altra per il riferimento.
Entrambe sono programmate per seguire lo stesso profilo di temperature, ed è misurata
la differenza in energia elettrica fornita alle due fornaci.

L'unica differenza tra le due fornaci dovrebbe essere, quindi, la presenza, in una delle
due, del campione. Le stesse considerazioni della DSC a flusso di calore sullo standard
interno si applicano qui, mentre teoricamente una misura dell'assorbimento di corrente
elettrica potrebbe non richiedere calibrazione, in quanto, nota la quantità di campione,
è già linearmente correlato al flusso di calore. In pratica, però, per ottenere risultati
più accurati si procede anche in questo caso ad una calibrazione analoga alla precedente.

Contrariamente alla DSC a flusso di calore nella DSC a compensazione di potenza il gradiente
di temperatura è impostato rispetto alla temperatura del campione. Pertanto, in teoria,
è lecito prevedere una maggior precisione di questo tipo di strumenti. In pratica, comunque,
non può essere ottenuto un controllo perfetto a causa del limite di misura della temperatura,
che è discreto e non continuo.

In breve, entrambi i modelli sono in commercio da oltre 30 anni e nessuno dei due si è imposto
sull'altro in quanto le performance sono molto simili in termini di accuratezza e precisione.

Le fornaci a compensazione di potenza sono generalmente più piccole e permettono quindi
riscaldamenti e raffreddamenti più rapidi mentre le DSC a flusso di calore hanno una
baseline più stabile grazie al design a singola fornace.

\subsection{Grafici DSC}
Una grafico DSC è costituito da una curva dove la potenza è funzione della temperatura.

In assenza di fenomeni termici la linea di base del grafico è circa parallela all'asse
delle temperatura in quanto il $C_p$ varia poco con la temperatura. Assumendo $C_p$
costante in $dT$ si può scrivere:
\begin{align}
	dQ / dt = C_p \cdotp dT / dt
\end{align}

In seguito a calibrazione con lo strumento vuoto e con materiali di riferimento (\ce{Al2O3}),
e nota la massa del campione, quindi, si può correlare il valore in flusso di calore
nell'unità di tempo con il calore specifico della sostanza.

\subsubsection{Transizioni di primo ordine}
Le transizioni di primo ordine sono visibili, in DSC come in DTA, come picchi positivi
o negativi rispetto alla linea-base \en{baseline}.

Si ricorda che (cfr.\ pag.\ \pageref{trasformazioni_endo_eso}) le principali trasformazioni
endotermiche sono fusione, evaporazione e disidratazione mentre tra le esotermiche
ricordiamo cristallizzazione, condensazione ed ossidazione.

E' importante osservare che la direzione dell'asse Y, con il flusso di calore, non è
costante per tutti i tracciati DSC, bisognerà pertanto prestare attenzione e verificare
se, nel grafico d'interesse, i picchi esotermici presentino deviazioni positive o negative.
\begin{comment}
Le immagini schematiche dei picchi di fusione e cristallizzazione presenti nelle
slide provengono dal sito del Polymer Science Learning Center della University of Southern Mississipi
(\href{http://pslc.ws/macrog/dsc.htm}{Link}).
\end{comment}

Per convenzione in DTA le curve endotermiche sono rappresentante come negative, la
convenzione DSC invece, è (inutilmente) più complicata.
L'orientamento positivo o negativo dei picchi esotermici, infatti, dipende dalla tecnologia
impiegata per l'acquisizione dei dati: nelle DSC a compensazione di potenza i picchi
endotermici puntano verso l'altro mentre nelle DSC a flusso di calore le endoterme
sono negative.

Perché?

\paragraph*{Versione Corta} La differenza rispetta le direttive dell ICTAC
(International Conference on Thermal Analysis and Calorimetry) e si basa su argomentazioni
tecniche.\\
Nella pratica è bene verificare sempre se sia presente (dovrebbe esserci!) una freccia
con l'indicazione della direzione dell'asse (``exo'' o ``endo'', \ce{^} o \ce{v}).

\paragraph*{Versione Lunga} Nelle DSC a compensazione di potenza i picchi endotermici, ovvero
associati ad eventi che richiedono energia, sono positivi (ovvero puntano vero l'alto)
in quanto lo strumento deve fornire più potenza al campione per mantenere le due fornaci
(riferimento e campione) alla stessa temperatura.
Nelle DSC a flusso di calore, invece, gli stessi eventi che richiedono energia (es. fusione)
provocano l'assorbimento di calore da parte del campione che diventa quindi più freddo
della fornace (è proprio la differenza di temperatura maggiore a provocare il flusso di calore
maggiore che supplirà al calore aggiuntivo richiesto) e pertanto i picchi endotermici
puntano verso il basso.
In realtà oggi questa regola non è più strettamente seguita ma i due sistemi sono
usati indifferentemente, spesso con poca consapevolezza, da parte degli utilizzatori.
Si tratta, infatti, di una convenzione stabilità molti anni fa (l'introduzione delle prime DSC
risale agli anni Sessanta) e che, per quanto abbia un razionale tecnico, appare oggi
superata in quanto gli strumenti moderni, essendo digitali, permettono di generare il
tracciato DSC con la convenzione scelta dall'operatore. Ciò provoca inutile confusione
ed arbitrarietà che potrebbe essere superata allargando alla DSC la stessa convenzione
applicata alla DTA. Ma per ora non è così\ldots

\begin{comment}
In a power compensation DSC, the endothermic peaks those events which require energy
point up because the instrument must supply more power to the sample to keep the sample
and reference furnaces at the same temperature.
In a heat flux DSC, these same events cause the sample to absorb heat and be cooler
than the furnace, so they point down.
The reverse logic applies to exothermic events where energy is released.

The International Conference on Thermal Analysis and Calorimetry (ICTAC) set the
convention that curves should follow this pattern many years ago. (Most modern software
systems let you flip the curves as you like.)
\end{comment}

\subsubsection{Transizioni di secondo ordine}

Trasformazioni di secondo ordine, come la transizione vetrosa, saranno visibili come
alterazioni della linea di base (analogamente a quanto avviene in DTA), ad esempio
in figura \ref{Fig.:DSC_T_vetrosa_vitE} è riportata la transizione vetrosa della vitamina E.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/DSC_t_vetrosa_vit_E.png}
 % DSC_t_vetrosa_vit_E.png: 658x421 pixel, 96dpi, 17.41x11.14 cm, bb=0 0 493 316
 \caption{Tracciato DSC della transizione vetrosa della vitamina E}
 \label{Fig.:DSC_T_vetrosa_vitE}
\end{figure}

Nota che il cambiamento di $C_p$ non avviene ``a scalino'' ma la trasformazione richiede
$\approx 10\celsius$ e la temperatura a cui si verifica la transizione vetrosa dipende
dal gradiente di riscaldamento o raffreddamento. Ciò indica che si tratta di un fenomeno
cinetico oltre che termodinamico, anche per questo la transizione vetrosa non è una
trasformazione di secondo ordine ideale. Inoltre nella pratica spesso al cambio di $C_p$
è associata anche una curva esotermica, che può portare ad errate interpretazioni
come ad mostrato nella figura \ref{Fig.:DSC_t_vetro_polyactide}.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/DSC_t_vetrosa_polyactide.png}
 % DSC_t_vetrosa_polyactide.png: 478x323 pixel, 96dpi, 12.65x8.54 cm, bb=0 0 358 242
 \caption{Tracciato DSC di microsfere di polylactide con transizione vetrosa associata a picco esotermico.}
 \label{Fig.:DSC_t_vetro_polyactide}
\end{figure}

Il motivo per cui si verificano ``false esoterme'' in corrispondenza della temperatura
di transizione vetrosa è che gli stress subiti dal materiale in fase vetrosa (stress
prodotti da handling, processing or thermal history) sono rilasciati quando il materiale
è riscaldato in corrispondenza del punto di transizione vetrosa. Questo in quanto le
molecole riacquistano una struttura flessibile al posto di quella rigida della fase
vetrosa e come tali possono muoversi per scaricare lo stress subito.

Le false-esoterme associate alla $T_g$ possono essere eliminate se si scalda il campione
al di sopra della temperatura di transizione vetrosa ($T_g$) e lo si raffredda rapidamente.
In figura \ref{Fig.:DSC_Quench_cooling} è evidenziato come velocità di raffreddamento più
elevate diano i migliori risultati in termini di cancellazione dei picchi esotermici
nei successivi riscaldamenti prossimi a $T_g$.

\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/DSC_t_vetro_quench_cooling.png}
	% DSC_t_vetro_quench_cooling.png: 745x502 pixel, 96dpi, 19.71x13.28 cm, bb=0 0 559 376
	\caption{Effetto del quench-cooling sulle endoterme accoppiate alla transizione vetrosa.}
	\label{Fig.:DSC_Quench_cooling}
\end{figure}


\begin{comment}
	You're struggling to understand why, in DSC curve, the exothermic peaks in some graph
point up and in some other down? All this regardless heat flow constantly increasing
upwards in the y-axis? Have you found yourself in the situation where your book pretends
that the same convention of DTA is in place (ie. exothermic peaks up) but the DSC data
you're looking at clearly follow an opposite convention?

Well, you're right. At least you've pointed out a problem: The Problem.

(Not So) Short Version: It's an ICTAC fault: they decided two opposite conventions for different
type of DSC apparatus (power compensation and heat flow). What you can do is, at first,
looking for an arrow with ``exo'' or ``endo'' and see in which direction it points, if no
arrows are present you're left on your own, but reading the text associated with the graph usually
helps. Finally, if you're request to make comment on an ambiguos DSC graph, and you're not allowed to
ask for more information, than expect that you're professor has followed the same convention
that he or she had taught you of.

Long Version: Once upon a time there was DTA. It was (an is) an usefull thermal metod but, as all
the things on Earth, had it's glitches. Then someone stand up and invented DSC, wich overcame
some of the DTA limitations. We still were deeply in the analog age (mid Sixties) and
the curves were drawn by a pen with ink on paper, no PC, no post-processing.
The well-established DTA in the mean time had reached a good consensus on a convention,
approved by the International Conference on Thermal Analysis and Calorimetry (ICTAC),
stating that in DTA graphs, endothermic peaks had to be negative and exothermic positive.
It was (and is) a good convention for several technical reasons.
Tha comes the DSC, and problems arise. ICTAC decided that in power compensation DSC
the convention to be followed was opposite to that of heat flow instruments. That's madness.
\end{comment}

\subsection{Teoria}
Nota che nei grafici DSC l'area sottesa al picco è direttamente proporzionale al
calore prodotto o assorbito dalla reazione, inoltre l'altezza della curva è direttamente
proporzionale alla velocità di reazione.

In particolare viene calcolata la potenza, ovvero il flusso termico
nell'unità di tempo, dalla misura dell'intensità di corrente elettrica nella resistenza
che produce il calore che alimenta la fornace. Questo perché le misurazioni dell'intensità
di corrente elettrica sono semplici, estremamente precise e la conversione analogico-digitale
dei valori ottenuti è tecnicamente banale. Il fondamento teorico che mette in relazione
l'intensità di corrente elettrica al calore sviluppato è la legge di Omh
\begin{align}
	V &= iR \label{legge di Ohm}
\end{align}
sostituendo la differenza di potenziale $V$ nell'equazione della potenza ($P = V \cdotp i $)
si ottiene
\begin{align}
	P &= i^2 \cdotp R = \frac{dQ}{dt}
\end{align}
dove $P$ è la
potenza, $i$ l'intensità di corrente elettrica ed $R$ la resistenza\footnote{Si noti che
l'intensità di corrente elettrica è al quadrato, fattore che incrementa ulteriormente la sensibilità
dello strumento.}.

Viene pertanto misurato l'integrale di $dQ/dt$ in $dt$.
Assumiamo quindi che l'incremento di temperatura dipenda dal solo $C_p$ del campione
(ovvero che non si verifichino trasformazioni entalpiche).
Trattandosi di una misura ``differenziale'' si avrà:
\begin{align}
	\varDelta \left( \frac{dQ}{dt} \right) &= \left( \frac{dQ}{dt} \right)_x - \left( \frac{dQ}{dt} \right)_{rif}
\end{align}
ma poiché per definizione di DSC campione e riferimento vanno incontro alle stesse variazioni
di temperatura nel tempo si ha:\\
(I pedici ``x'' si riferiscono al campione mentre i pedici ``rif'' al riferimento.)
\begin{align}
	\left( \frac{dQ}{dt} \right)_x - \left( \frac{dQ}{dt} \right)_{rif} &=
	\left( \frac{dT}{dt} \right) \cdotp 
	    \left[
		\left( \frac{dQ}{dT} \right)_x - \left( \frac{dQ}{dT} \right)_{rif}
	    \right]
\end{align}
Ricordando che $C_p$ è definito come $dQ/dT$, ed osservando che $dT/dt$ non è altro
che la velocità di scansione della temperatura ($\beta$), si ottiene:
\begin{align}
	&= \beta x (m_x \cdotp C_{p, x} - m_rif \cdotp C_{p, rif})
\end{align}

Dal tracciato ottenuto con la cella portacampione vuota ($m_x = 0$) si ottiene:
\begin{align}
	\left( \frac{dQ}{dt}\right)_rif &= \beta \cdotp m_x C_{p,rif}
\end{align}
ovvero i valori di $C_{p, rif}$ per ogni temperatura, necessari per trovare il
valore assoluto del $C_{p, x}$ e non sono la sua differenza col riferimento.

Sottraendo il tracciato della cella vuota si ottiene il dato ``pulito'', ovvero riferito al
solo campione:
\begin{align}
\left( \frac{dQ}{dt}\right)_x &= \beta \cdotp m_x C_p,x
\end{align}

Poiché nei grafici DSC è automaticamente sottratto il parametro riferito al riferimento
si ha che la linea di base è descritta dall'equazione:
\begin{align}
\left( \frac{dQ}{dt}\right)_{baseline} &= \beta \cdotp m_x C_p,x
\end{align}
Essendo note la massa del campione ($m_x$) e la velocità di scansione ($\beta$) si può
ricavare quindi $C_{p, x}$ in funzione di $T$.

Ricorda che per poter calcolare con precisione i $C_p$ con DSC è necessario effettuare
apposite calibrazioni con standard di riferimento! Al di là del significato fisico della
linea di base, comunque, la sua importanza è grande anche solo in riferimento al calcolo
delle entalpie delle transizioni termiche in quanto il calcolo dell'area parte appunto
dalla linea di base (e non dal valore di flusso = 0!).

Nella definizione delle transizioni di primo ordine era stato sottolineato come
esse coinvolgesse sia calore latente sia variazioni del $C_p$.
Ciò è reso evidente dai picchi DSC dove si possono notare significativi scostamenti
della linea di base, ovvero del $C_p$, in corrispondenza di picchi eso/endotermici.
Ciò può provocare delle complicazioni nel calcolo dell'entalpia delle trasformazioni in quanto, come detto,
quest'ultima è proporzionale all'area compresa tra il picco e la linea di base, e variazioni
alla linea di base la rendono meno semplice da calcolare tale area.

\subsection{Calcolo della purezza}
\label{punto fusione DSC}
L'utilizzo della DSC nel calcolo della purezza può essere visto come un punto di fusione
molto migliorato, non a caso la DSC sta progressivamente soppiantando in molti campi
i tradizionali metodi con punto di fusione.
Le ragioni del successo risiedono nel fatto che la DSC fornisce più informazioni e più
accurate rispetto al semplice p.f.

La determinazione della purezza in DSC si basa sull'assunzione che impurezze eventualmente
presenti nella sostanza analizzata ne abbassino il punto di fusione (per Raoult o
per formazione di una miscela eutettica).

L'effetto di impurezze eutettiche nell'abbassamento del punto di fusione è descritto dalla
equazione di Van't Hoff per la quale, nella sua forma semplificata, si ha:
\begin{align}
	T_f &= T_0 - \frac{R T_0^2}{\varDelta H_f} x_2 \frac{1}{F}
\end{align}
dove $T_f$ è la temperatura di fusione (che, durante la fusione, segue la temperatura del
liquido formatosi), $T_0$ è la temperatura di fusione della sostanza pura, $R$ è la
costante dei gas, $\varDelta H_f$ l'entalpia di fusione, $x_2$ la concentrazione
(espressa come frazione molare) dell'impurezza presente ed F la frazione fusa.

Osservando la formula si nota che l'abbassamento nella temperatura di fusione rispetto
a quello della sostanza pura $T_0$ dipende linearmente dalla frazione molare di impurezza presente.

Tutti i valori presenti nell'equazione di Van't Hoff possono essere determinanti mediante
DSC se è nota la temperatura di fusione della sostanza pura.

\begin{align}
	\frac{1}{F} &= \frac{A_{tot} + c}{A_{parz} + c}
\end{align}
Il reciproco della frazione fusa è correlabile al rapporto tra l'area totale e
l'area parziale del picco alla temperatura $T_f$ (variabile dipendente), mentre l'entalpia
di fusione è calcolabile dall'area totale del picco.

Chiaramente anche impurezze non eutettiche possono avere effetto sul punto di fusione
ed in casi eccezionali (ad es.\ nel caso di cristalli misti) possono anche causarne un incremento.
Impurezze che formano un sistema liquido di due fasi immiscibili (es.\ vanillina ed
ossido di ferro) non hanno effetto sul punto di fusione.
Questo tipo di impurezze non può pertanto essere determinato mediante DSC (se non per
un minore calore latente di fusione, che però non offre la precisione necessaria
a quantificare impurezze presenti in piccole quantità).

Una volta che la o le principali impurezze che contaminano una sostanza sono state
individuate (es.\ mediante HPLC), quindi, il primo passo da compiere per verificare se si può
impiegare la DSC in produzione come controllo di qualità per la purezza della sostanza
in esame è studiare se l'impurezza forma o meno una miscela eutettica con il campione.

Sono quindi aggiunte aliquote crescenti di impurezza al campione puro (o al massimo grado
di purezza disponibile) e si verifica se l'impurezza segue l'andamento previsto dalla
regola di Van't Hoff o meno.

\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/DSC_purezza_pmolo.jpg}
	% DSC_purezza_pmolo.jpg: 389x291 pixel, 113dpi, 8.74x6.54 cm, bb=0 0 248 185
	\caption{DSC scan e analisi della purezza di paracetamolo Reference Standard (2,11mg, gradiente 1\celsius /min)}
	\label{Fig.:DSC_Purezza_PMolo}
\end{figure}

In figura \ref{Fig.:DSC_Purezza_PMolo} è mostrato lo studio di purezza condotto sullo
standard di riferimento per il paracetamolo, la retta rappresenta l'andamento previsto
dall'equazione di Van't Hoff per valori crescenti d'impurezza mentre la curva sovrapposta
è l'andamento sperimentale.
Si verifica una differenza non significativa per alti valori
di purezza, che è la parte più ``utile'' della curva\footnote{\textit{However, users should
be aware of the fact that previous DSC term results are only reliable for compounds which are
highly pure (98\% or above), have sharp melting points, and do not have thermal events that
interfere with their melting endotherms.}}.
\href{http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2008.12.030}{doi:10.1016/j.jpba.2008.12.030}.
(Si ricordi che il paracetamolo è ``solo'' uno standard secondario, mentre purezze del $100\%$
possono essere più facilmente ottenute ad es.\ con standard primari come il propil parabene.)

Nota poi che con quantità crescenti di impurezza eutettico cresce conseguentemente
l'ampiezza del picco di temperatura eutettica, che si trova in genere ad una temperatura
più bassa della temperatura di fusione del composto puro di $10$-$100\celsius$.

\esame[28/3/11]{Calorimetria a scansione differenziale. Illustrare le diverse tecniche
utilizzate, il funzionamento della strumentazione e le informazioni che possono essere ottenute.}
Il principale vantaggio dell'impiego della DSC nel controllo della purezza è la rapidità
del metodo mentre le limitazioni sono date dalla necessità di campioni molto puri ($> 98\%$),
dalla formazione di impurezze eutettiche, dall'influenza della granulometria e dalla presenza di
aria nel campione. Questi problemi si sommano a quelli relativi alla DSC in quanto tale,
ovvero calibrazione, caricamento del campione, lag termico per gradienti elevati,
solventi residui, errori d'interpretazione etc.

\subsection{Solventi residui}
\esame[2/5/11]{Descrivere i fenomeni osservabili mediante DSC ed illustrare le applicazioni
nella farmaceutica di questa tecnica.}
In conclusione l'analisi termica ifenata con tecniche analitiche (FT-IR, MS, GC) permette
un'esatta identificazione e quantificazione (lod $\approx 10ppm$) con campioni esigui
(pochi mg).
In ambito farmaceutico la DSC può essere impiegata anche per l'analisi dei solventi residui,
in particolare se ifenata ad FT-IR.
Per evidenziare lo sviluppo di solventi residui durante un'analisi DSC si possono confrontare
le aree dei picchi di fusione tra portacampione chiuso e aperto.

% Slide prof. tratte da
% "Thermoanalytical Characterization of Pharmaceuticals" netzsch annual 2000
% introvabile gratis online, costa 59€, presente solo presso la biblioteca di Trieste -.-``

Un solvente può essere incorporato in una forma farmaceutica in diverse forme:
\begin{itemize}
	\item[libero] il solvente libero è in equilibrio con il suo vapore dove la tensione
	di vapor saturo dipende dal tipo di solvente e dalla temperatura, è il caso più
	semplice individuabile anche mediante termogravimetria.
	La massima perdita di peso si avrà in corrispondenza della temperatura di
	ebollizione del solvente.
	Vedi figura \ref{Fig.:Solvente_libero};

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/Solvente_residuo.png}
 % Solvente_residuo.png: 801x468 pixel, 96dpi, 21.19x12.38 cm, bb=0 0 601 351
 \caption{Analisi termica dell'etile acetato, curve TG, DTG e DTA}
 \label{Fig.:Solvente_libero}
\end{figure}

	\item[adsorbito] il solvente adsorbito è fissato alla superficie o nelle porosità
	di una matrice solida in un processo reversibile ed esotermico\footnote{Quindi
	lo svolgimento del solvente sarà endotermico};
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/dsc_solvent_adsorbed.png}
 % dsc_solvent_adsorbed.png: 700x401 pixel, 96dpi, 18.52x10.61 cm, bb=0 0 525 301
 \caption{Acetato di etile adsorbito dal nftopidil (rilasciato a $127\celsius$)}
 \label{Fig.:DSC_solvente_adsorbito}
\end{figure}


	\item[incluso] il solvente è incluso in gocce nell'abito cristallino durante
	la cristallizzazione, viene pertanto liberato al punto di fusione del cristallo;

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/Solvente_residuo_Zalplon_intercalato.png}
 % Solvente_residuo_Zalplon_intercalato.png: 692x410 pixel, 96dpi, 18.31x10.85 cm, bb=0 0 519 307
 \caption{Etile acetato residuo intercalato nello Zaleplon, come evidenziato dal tracciato
	FTIR}
 \label{Fig.:Solvente_intercalato_zaleplon}
\end{figure}

	\item[intercalato] il solvente si intercala tra gli strati di un solido con
	conservazione della struttura a strati. Non ci sono limiti alla natura dell'agente
	intercalante né al meccanismo d'intercalazione. Si tratta di un fenomeno
	diverso rispetto a solvente libero ed adsorbito come è evidenziato dalla diversa
	tensione di vapor saturo.
\end{itemize}

\addcontentsline{toc}{part}{Interazione della materia con le onde elettromagnetiche}
\chapter{Interazioni materia -- fotoni}

\section{Introduzione}
\subsection{Onde piano polarizzate}
Se si considera un'onda elettromagnetica che propaga nello spazio lungo l'asse z essa è
formata da un campo elettrico che oscilla nel piano perpendicolare alla direzione di
propagazione, ad es. x, e da una componente magnetica data dal prodotto vettoriale tra il
vettore di propagazione e quello del campo elettrico\footnote{Ne segue che essendo i due
in questo caso perpendicolari il prodotto tra io moduli moltiplicato per il seno dell'angolo
compreso si semplifica qui al solo prodotto dei moduli, essendo il seno di 90\degree\ pari ad 1.
E' comunque importante sottolineare che si tratta di un prodotto vettoriale in quanto il risultato
è un vettore e non uno scalare.}.
Un'onda piano polarizzata è rappresentata in figura \ref{Fig.: Onda_piano_pol} dove si notano
i fronti d'onda planari da cui ne deriva il nome.

\begin{figure}[hbtp]
\centering
\label{Fig.: Onda_piano_pol}
\includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{img/luce_piano_pol.png}
\caption{Rappresentazione del vettore elettrico di un'onda piano polarizzata}
\end{figure}

\textit{Nota: i video mostrati a lezione sono tratti da \href{http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo0.htm}{\url{http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo0.htm}}}.

\subsection{Composizione di onde piano polarizzate}
Onde piano polarizzate diverse possono sommarsi con le normali regole di composizione per i vettori.
Ad esempio, se si sovrappongono due onde piano polarizzate di eguale lunghezza d'onda,
intensità ed in fase tra loro, aventi vettori elettrici tra loro perpendicolari
(nell'esempio di cui sopra vettori $\vec{E}$ giacenti lungo gli assi x ed y) si ottiene un'onda
piano polarizzata avente campo elettrico di intensità pari a $\sqrt{2}$ rispetto alle precedenti
e orientato a 45\degree.

\subsection{Onde circolarmente polarizzate}
Se, invece, si sovrappongono due onde piano polarizzate "uguali" ma aventi vettori elettrici tra loro perpendicolari
e fuori fase l'uno rispetto all'altro di 90\degree\ si possono ottenere onde circolarmente polarizzate a destra
o sinistra a seconda del segno della differenza di fase: $+90\degree$ o $-90\degree$\footnote{I due casi sono
diversi perché i vettori campo elettrico hanno andamento sinusoidale, ed il seno è una funzione periodica di periodo $2\pi$,
ovvero 360\degree nel sistema sessagesimale}. Un'onda circolarmente polarizzata destrorsa è mostrata in figura
\ref{Fig.: Onda_circolar_pol}.

\begin{figure}[hbtp]
\label{Fig.: Onda_circolar_pol}
\includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{img/luce_circola_pol.png}
\caption{Rappresentazione del vettore elettrico di un'onda circolarmente polarizzata}
\end{figure}

Il fatto che la luce circolarmente polarizzata possa essere vista come composizione di due onde
piano polarizzate risulta evidente se se ne scompongono le componenti $x,y$: esse sono, infatti,
due sinusoidi tra loro ``sfasate'' di $90\degree$.

Se si analizzano le differenze tra componenti $x$ ed $y$ di onde circolarmente polarizzate, infine,
si nota che hanno una componente identica e l'altra in anti-fase.
Questo perché essendo l'una $+90\degree$ e l'altra $-90\degree$ la loro differenza
è $180\degree$, ovvero mezzo periodo, il che le rende anti-fase ovvero la loro somma è nulla.
Da ciò si evince che la composizione di due onde circolarmente polarizzate identiche
se non per il fatto che l'una è destrorsa e l'altra sinistrorsa da' un'onda piano-polarizzata.

\subsection{Interazioni onde-materia}
I principali fenomeni a cui può andare incontro un'onda elettromagnetica attraversando un materiale non
riflettente sono assorbimento e rifrazione.

\paragraph*{Assorbimento} L'assorbimento comporta una diminuzione nell'intensità dell'onda.
\paragraph*{Rifrazione} La rifrazione è causata dalla minor velocità della luce nel mezzo attraversato
rispetto all'aria e provoca quindi un accorciamento della lunghezza d'onda, in quanto la frequenza resta
costante e $\lambda / f = \vec{v}$ ovvero il rapporto tra lunghezza d'onda e frequenza è uguale alla
velocità di propagazione dell'onda. Se la velocità diminuisce la lunghezza d'onda deve accorciarsi.

\subsection{Dicroismo Circolare}
\definizione{Il dicroismo circolare è la proprietà di alcuni materiali di assorbire diversamente la luce circolarmente
polarizzata destra rispetto alla sinistra.}
Ciò è visibile anche nella luce piano polarizzata, in quanto
questa ultima può essere vista come il prodotto di due onde circolarmente polarizzate di cui una viene più
assorbita, il risultato è che l'altra sarà più intensa. Si otterrà pertanto un'onda elettromagnetica ellittica,
detta luce ellitticamente polarizzata.

L'asse maggiore dell'ellisse ha l'orientamento dell'onda piano polarizzata originaria, mentre il verso della
rotazione è funzione dell'onda meno assorbita.

Nota che è quasi impossibile trovare un materiale che assorba solo una delle due componenti della luce piano
polarizzata, più spesso l'assorbimento delle due sarà diverso: maggiore per l'una e minore per l'altra.
Se il l'assorbanza è abbastanza alta ed il cammino ottico sufficientemente lungo si può arrivare anche al caso
limite in cui una delle due componenti sia assorbita quasi completamente, nel tal caso l'onda uscente sarà
quasi-circolare.

\subsection{Birifrangenza Circolare}
\definizione{La birifrangenza circolare\footnote{La birifrangenza circolare è cosa diversa dalla birifrangenza, proprietà di alcuni
cristalli.} è la proprietà di alcuni materiali di avere indici di rifrazione diversi per la luce
circolarmente polarizzata destra rispetto alla sinistra.}

Se un raggio di luce piano polarizzata attraversa un mezzo mostrante birifrangenza circolare ne risulta che una
delle due componenti (destra o sinistra) è ``rallentata'' più dell'altra. Una volta uscite dal mezzo, quindi, le
due componenti (circolare destrorsa e sinistrorsa) della luce piano polarizzata torneranno ad avere la stessa
velocità ma non saranno più  in fase come prima, ovvero saranno ruotate l'una rispetto all'altra
rispetto al sistema di riferimento precedente avente per asse il vettore campo elettrico della luce piano polarizzata.
Ne segue che anche la loro composizione, che è la luce piano polarizzata, ne risulterà alterata, in particolare
si osserverà una rotazione del vettore campo elettrico.

Anche in questo caso più che di materiali che rifrangono una sola delle due luci circolarmente polarizzate, è più
corretto pensare ad un materiale che rifranga entrambe ma in modo quantitativamente diverso.

\subsection{Materiali otticamente attivi}
Materiali che ``ruotino'' o ``rendano ellittica'' la luce piano polarizzata, ovvero che mostrino
dicroismo o birifrangenza circolari, sono detti otticamente attivi.

In genere un materiale otticamente attivo mostra sia dicroismo sia birifrangenza circolari.
Le molecole chirali sono otticamente attive mentre le molecole achirali\footnote{Ricorda
che chirali non significa ``che possiedono carboni asimmetrici'' tout court, ma che
non siano sovrapponibili alla propria immagine speculare} non lo sono.
Questo perché la rotazione dell'asse di rotazione della luce è dato dall'interazione
con gli elettroni delle molecole e più in particolare con i campi magnetici da essi generati.
Se una sostanza è achirale, statisticamente, per ogni molecola con un'orientazione
spaziale ne esiste un'altra con l'orientazione opposta, e pertanto i loro effetti sui fotoni si annullano.
Nel caso di molecole achirali, invece, non esistendo l'immagine speculare di ogni
molecola si possono creare asimmetrie che sono lette come dicroismo e birifrangenza circolari.

\subsection{Legge di Biot}
La \emph{rotazione ottica} è l'entità (in gradi) della rotazione della luce piano
polarizzata da parte di molecole chirali.
Si tratta, quindi, di una misura di birifrangenza circolare e dipende da diversi
parametri riassunti nella legge di Biot per la rotazione specifica\footnote{Nota
che i valori di rotazione ottica sono espressi con $\alpha$ mentre la rotazione
specifica è $[\alpha]$, con le parentesi quadre ed, eventualmente, apici e pedici
per temperatura e lunghezza d'onda.}:
\begin{align}
	[\alpha]^T_{\lambda}  &= \frac{\alpha}{l \cdotp c} \qquad \text{u.d.m.}\; \frac{[\degree]}{[dm] \cdotp [g/mL]}
\end{align}
Dove T è la temperatura (generalmente 20 o 25 \celsius) $\lambda$ la lunghezza d'onda (di norma la linea D del sodio), $\alpha$ la
rotazione ottica misurata, $l$ la lunghezza del cammino ottico (espressa in \si{\deci \meter}) e $c$ la concentrazione (in
\si{\gram \per \milli \liter}).
La dipendenza della rotazione ottica dalla lunghezza d'onda è anche detta ``dispersione ottica rotatoria''
(v.\ oltre a pag.\ \pageref{Dispersione Ottica Rotatoria}).

I valori di $[\alpha]$ a $20,0\celsius$ e con $\lambda$ pari alla linea D del sodio sono talvolta indicati con $\alpha^0$.

\subsubsection{Potere ottico in Ph.Eur.}
Al potere ottico è dedicata una monografia dei metodi d'analisi della Farmacopea
Europea.

\begin{PhEur}[OPTICAL ROTATION]{2.2.7}
Optical rotation is the property displayed by chiral substances
of rotating the plane of polarisation of polarised light.
Optical rotation is considered to be positive ($+$) for
dextrorotatory substances (i.e.\ those that rotate the plane
of polarisation in a clockwise direction) and negative ($-$) for
laevorotatory substances.

The specific optical rotation $[\alpha_m]^t_\lambda$ is the rotation, expressed
in radians (rad), measured at the temperature $t$ and at
the wavelength $\lambda$ given by a $1 \meter$ thickness of liquid or a
solution containing $1 \si{\kilo \gram \per  \cubic \meter }$ of optically active substance.
For practical reasons the specific optical rotation $[\alpha_m]^t_\lambda$ 
is normally expressed in milliradians metre squared per
kilogram ($\si{\milli \radians \meter \squared \per \kilo \gram}$).

The Pharmacopoeia adopts the following conventional
definitions.

The \emph{angle of optical rotation} of a neat liquid is the angle
of rotation $\alpha$, expressed in degrees ($\degree$), of the plane of
polarisation at the wavelength of the D-line of sodium
($\lambda = 589.3 \nm$) measured at $20 \celsius$ using a layer of $1 \dm$;
for a solution, the method of preparation is prescribed in
the monograph.

The \emph{specific optical rotation} $[\alpha]_D^{20}$ of a liquid is the angle
of rotation $\alpha$, expressed in degrees ($\degree$), of the plane of
polarisation at the wavelength of the D-line of sodium
($\lambda = 589.3 \nm$) measured at $20 \celsius$ in the liquid substance to
be examined, calculated with reference to a layer of 1 dm
and divided by the density expressed in grams per cubic
centimetre.

The \emph{specific optical rotation} of a substance in solution is the angle
of rotation $\alpha$, expressed in degrees ($\degree$), of the plane of
polarisation at the wavelength of the D-line of sodium
($\lambda = 589.3 \nm$) measured at $20 \celsius$ in a solution of
the substance to be examined and calculated with reference
to a layer of $1 \dm$ containing $1 \si{\gram \per \milli \liter}$ of the substance.
The specific optical rotation of a substance in solution
is always expressed with reference to a given solvent and
concentration.

In the conventional system adopted by the Pharmacopoeia
the specific optical rotation is expressed by its value
without units; the actual units, degree millilitres per
decimetre gram [$(\degree)\cdotp \ml \cdotp \si{\per \deci \meter} \cdotp \si{\per \gram}$] are understood.

The conversion factor from the International System to the
Pharmacopoeia system is the following :
\begin{align*}
	[\alpha_m]^t_\lambda &= [\alpha]^t_\lambda X 0,1745
\end{align*}

In certain cases specified in the monograph the angle of
rotation may be measured at temperatures other than $20 \celsius$
and at other wavelengths.

The polarimeter must be capable of giving readings to the
nearest $0.01\degree$. The scale is usually checked by means of
certified quartz plates. The linearity of the scale may be
checked by means of sucrose solutions.

\paragraph*{Method} Determine the zero of the polarimeter and the
angle of rotation of polarised light at the wavelength of
the D-line of sodium ($\lambda = 589.3 \nm$) at $20 \pm 0.5 \celsius$, unless
otherwise prescribed. Measurements may be carried out at
other temperatures only where the monograph indicates the
temperature correction to be made to the measured optical
rotation. Determine the zero of the apparatus with the tube
closed; for liquids the zero is determined with the tube
empty and for solids filled with the prescribed solvent.
Calculate the specific optical rotation using the following
formulae.

For neat liquids:
\begin{align*}
	[\alpha]^{20}_D &= \frac{\alpha}{l \cdotp \rho_{20}}
\end{align*}

For substances in solution:
\begin{align*}
	[\alpha]^{20}_D &= \frac{1000 \alpha}{l \cdotp c}
\end{align*}

where $c$ is the concentration of the solution in grams per
litre.

Calculate the content $c$ in grams per litre or the content $c'$
in per cent $m/m$ of a dissolved substance using the following
formulae:
\begin{align*}
	c &= \frac{1000 \alpha}{l \cdotp [\alpha]^{20}_D} \\
	c' &= \frac{100 \alpha}{l \cdotp [\alpha]^{20}_D \cdotp \rho_{20}} 
\end{align*}

\begin{align*}
\alpha &= \text{angle of rotation in degrees read at $20 \pm 0.5 \celsius$;} \\
l &= \text{length in decimetres of the polarimeter tube;} \\
\rho_{20} &= \text{density at $20 \celsius$ in grams per cubic centimetre.} \\
& \text{For the purposes of the Pharmacopoeia, density} \\
& \text{is replaced by relative density (2.2.5).}
\end{align*}
\end{PhEur}


\subsection{Parametri di purezza enantiomerica}
La quantità di un enantiomero rispetto all'altro in una miscela di racemato ed enantiomero puro può essere espressa in vario
modo. E' sempre importante indicare quanto sia puro un singolo enantiomero in quanto è estremamente difficile avere purezze
assolute; i diversi parametri rispettano le diverse grandezze impiegate per calcolarli.

\subsubsection{Purezza Ottica}
La purezza ottica ($P.O. \%$) è definita come il rapporto tra la rotazione ottica misurata per il campione in rapporto alla
massima rotazione ottica riportata in letteratura ed attribuita a quell'enantiomero puro.
Ne segue che la purezza ottica è un indice utilizzato quando la purezza enantiomerica
è misurata mediante polarimetria.
E' importante ricordare che la rotazione ottica risente di numerosi fattori quali
lunghezza d'onda, temperatura etc.,\ e pertanto è necessario, per ottenere valori confrontabili,
operare nelle stesse condizioni del valore tabulato.

\begin{align}
P.O. \% &= \frac{[\alpha]_{obs}}{[\alpha]_{max}} \cdotp 100
\end{align}

\subsubsection{Eccesso Enantiomerico}
L'eccesso enantiomerico ($ee$), a differenza della purezza ottica, non è legato
a un metodo in particolare e può essere determinato in vari modi (HPLC, NMR etc.).
Esso è definito come la percentuale di enantiomero puro rispetto al racemato
(ovvero alla somma dei due enantiomeri).
\begin{align}
ee &= \frac{|R - S|}{R + S} * 100 = |\%R - \% S|
\end{align}

\section{Polarimetria}
\definizione{La polarimetria è un metodo di analisi non distruttivo che si basa
sull'attività ottica di composti chirali.}

Si tratta di una misurazione semplice, pratica e veloce che non richiede apparecchiature costose, parametri che
ne spiegano il successo in ambito alimentare (es.\ per misurare la concentrazione di zuccheri otticamente attivi).

La luce piano polarizzata è ottenuta mediante filtri polarizzanti a partire da una sorgente di luce monocromatica.
Si possono avere i seguenti tipi di filtri:
\begin{itemize}
	\item prisma di Nicol;
	\item filtri Polaroid.
\end{itemize}

\subsection{Polarizzatori}
\subsubsection{Prisma di Nicol}
Il prisma di Nicol fu inventato nel 1828 dall'inglese William Nicol e, per quanto sia piuttosto bizzarro, resta un
metodo di generazione di luce polarizzata semplice e preciso.

Il prisma di Nicol è formato da un cristallo di carbonato di calcio tagliato diagonalmente con un lato annerito e
saldato con una sostanza con elevato indice di rifrazione (originariamente il balsamo del Canada).
Tecnicamente sfrutta la birifrangenza dei cristalli anisotropi.

\paragraph*{Birifrangenza} La birifrangenza dei mezzi anisotropi \emph{non} deve essere confusa con la birifrangenza
circolare. In questo caso si parla della particolare proprietà di alcuni materiali di scomporre la radiazione luminosa
che li attraversa in due fasci (i cosiddetti raggi ordinario e straordinario) aventi campi elettrici perpendicolari e
di cui il secondo è un fascio di luce piano polarizzata.

Per ottenere un fascio di luce polarizzata mediante un cristallo anisotropo (come il carbonato di calcio) bisogna quindi
poter ``selezionare'' il raggio straordinario dall'ordinario. Ciò è ottenuto con il balsamo del Canada interposto
tra le facce diagonali del prisma.

Il motivo è che l'indice di rifrazione del balsamo del Canada è di $1,55$, che corrisponde ad un angolo limite\footnote{L'angolo
limite è l'angolo oltre il quale si verifica la riflessione totale. Vedi anche rifrattometria a pag.\ \pageref{Rifrattometria}}
rispetto alla perpendicolare di $69\degree$.
I raggi prodotti per birifrazione, come detto, si separano, ovvero sono rifratti con angoli diversi.
Nel caso del carbonato di calcio questi angoli sono tali che il raggio ordinario subisca riflessione totale nell'interazione
con la faccia diagonale, ovvero torni indietro nel prisma per terminare sull'estremità annerita; al contrario
il raggio straordinario è rifratto nel secondo prisma che, essendo identico al primo, provvede a raddrizzarlo.
Se ne ottiene un raggio di luce piano polarizzata parallelo al raggio incidente originario.

\subsubsection{Filtro Polaroid}
Il filtro Polaroid è formato da materiale dicroico allineato nel processo di produzione mediante un campo magnetico e deposto
su di una membrana polimerica trasparente (nitrocellulosa). Il risultato è un disco polarizzatore.

\subsection{Polarimetro}
Il polarimetro, ovvero lo strumento che esegue le misure di polarimetria, è formato da:
\begin{itemize}
	\item una sorgente di luce monocromatica (in genere una lampada al sodio);
	\item un primo filtro polarizzatore che generi la luce polarizzata per l'analisi;
	\item una cella portacampione di lunghezza nota contenente generalmente una soluzione della sostanza da analizzare;
	\item un secondo filtro polarizzatore ruotabile e per il quale l'entità della rotazione corrisponde al valore di $\alpha$;
	\item un oculare che permetta all'operatore di identificare il punto zero.
\end{itemize}

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=12cm,keepaspectratio=true]{./img/Pol_base.png}
 % Pol_base.png: 500x134 pixel, 72dpi, 17.64x4.73 cm, bb=0 0 500 134
 \caption{Schema generale di un polarmetro.}
 \label{Fig.:Pol_base}
\end{figure}

Inizialmente il filtro dell'analizzatore è azzerato, ovvero lo si ruota con il portacampione
vuoto in modo che non vi sia luce passante.
Ciò avviene quando l'angolo tra i due filtri è di $90\degree$.
Se viene immessa nel tubo portacampione una sostanza otticamente non attiva non
si avrà rotazione della luce piano polarizzata e l'oculare resterà buio.
Al contrario, se una sostanza otticamente attiva è posta nel portacampione,
la rotazione indotta sul fascio di luce polarizzata farà sì che l'oculare non sia più buio.
L'entità della rotazione ottica è data dai gradi necessari al filtro
analizzatore per rendere nuovamente buio l'oculare.
Le due direzioni di rotazione sono caratterizzati da segni opposti, $+$ per
sostanze destrogire e $-$ per le levogire.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=12cm,keepaspectratio=true]{./img/Pol_Lippich.png}
 % Pol_Lippich.png: 780x207 pixel, 72dpi, 27.51x7.30 cm, bb=0 0 780 207
 \caption{Schema di un polarimetro di Lippich}
 \label{Fig.:Pol_Lippich}
\end{figure}

\subsubsection{Polarimetro di Lippich}
\esame[31/1/11]{Polarimetria: definire il potere ottico rotatorio specifico e
descrivere il funzionamento di un polarimetro.}
Poiché questo sistema non è molto preciso ne è stato sviluppato un altro analogo
ma caratterizzato dall'impiegare per l'analisi due fasci di luce generati da due
filtri polaroid con inclinazioni diverse, è il polarimetro di Lippich (fig.\ \ref{Fig.:Pol_Lippich}).
Il filtro analizzatore resta unico e pertanto l'entità di luce passante per i due fasci sarà diversa.
Tale quantità di luce sarà uguale solo quando i due raggi formano con l'analizzatore lo stesso angolo.
Questo costituisce il nuovo punto zero, di più facile, rapida e precisa individuazione
in quanto l'oculare risulta ora bipartito (vedi figura \ref{Fig.: Pol_oculare}) e
l'operatore non deve far altro che rendere uguale l'intensità luminosa delle due parti.
La procedura d'analisi in seguito all'azzeramento è identica al sistema precedente.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=4cm,keepaspectratio=true]{./img/Pol_oculare.png}
 % Pol_oculare.png: 229x199 pixel, 72dpi, 8.08x7.02 cm, bb=0 0 229 199
 \caption{Oculare bipartito di un polarimetro}
 \label{Fig.: Pol_oculare}
\end{figure}


\section{Cromatografia chirale}
Al posto della polarimetria nella determinazione della purezza di composti chirali si possono usare HPLC chirale ed NMR.

L'HPLC chirale può essere seguita con fasi stazionarie chirali, o con additivi chirali nella fase mobile, oppure
ancora si possono creare per via chimica diastereoisomeri a partire da enantiomeri e separarli con HPLC classica.

\subsection{CSP -- Chiral Stationary Phase}
Oggi in commercio esistono diversi tipi di fasi stazionarie chirali.
Per poter avere una separazione chirale sono necessarie almeno tre interazioni.
Tali interazioni possono essere anche molto deboli in quanto il processo di separazione è multi-step e pertanto
la separazione è comunque raggiunta, non per l'elevata differenza energetica tra i due stati ma per il grande
numero di ripetizioni della separazione.

Le CSP possono essere raggruppate in base alla loro struttura chimica:
\begin{itemize}
	\item Pirkle (o ``a pennello'');
	\item cellulosa;
	\item ciclodestrine;
	\item antibiotici macrociclici;
	\item proteine;
	\item a scambio di ligando;
	\item eteri corona.
\end{itemize}

\subsubsection{Brush-type (Pirkle)}
Le colonne Pirkle sono basate sull'interazione con residui aromatici, in particolare ce ne sono due tipi: fasi $\pi$-$\pi$-accettore
e $\pi$-$\pi$-donatore, per anelli elettronricchi ed elettronpoveri.
La chiralità della fase stazionaria è data da sostituenti chirali sull'anello, es. fenilglicina.

\subsubsection{Cellulosa}
Le colonne in cellulosa separano gli enantiomeri grazie ad interazioni attrattive e complessi di inclusione, sono prodotte
dalla Daicell e trovano ampia applicazione in ambito farmaceutico.
I loro limiti sono dati dall'impossibilità di utilizzare solventi clorurati (per il rischio di danneggiare la fase stazionaria)
e la necessità di utilizzare fasi mobili a bassa polarità.

\subsubsection{Ciclodestrine}
Le ciclodestrine sono oligosaccaridi ciclici contenenti da 6 a 12 unità di glucosio prodotte da un enzima
ingegnerizzato per crearne di diverse dimensioni (6, 7 e 8 Glc, rispettivamente $\alpha$, $\beta$ e $\gamma$).

La ciclodestrina ha ossidrili secondari sul rivestimento della bocca e ossidrili primari sul fondo, mentre l'interno
è relativamente idrofobico e può includere porzioni idrofobiche di soluto\footnote{Si ricordino le applicazioni in
tecnica farmaceutica delle cicliodestrine proprio per veicolare sostanze poco polari in ambiente acquoso}.

Il problema di questa classe di colonne è la lentezza della cinetica di interazione che comporta il broadening
dei picchi che ne limita le applicazioni preparative. Inoltre per l'interazione con la ciclodestrina è necessario
che la sostanza da analizzare possa formare legami ad idrogeno.

\subsubsection{Antibiotici macrociclici}
Fasi stazionarie più recenti si basano su antibiotici macrociclici immobilizzati su fasi stazionarie in gel di silice

\subsubsection{Proteine}
Le fasi stazionarie proteiche hanno caratteristiche diverse a seconda della proteina legata, in ogni caso tutte hanno
capacità di carico basse e portate piccole il che le rende poco utili a fini preparativi, anche se molto usate
per altre applicazioni.

\paragraph*{$\alpha$-glicoproteina umana} L'$\alpha$-glicoproteina (AGP) acida umana è una piccola proteina acida (181 residui
amminoacidici e 40 di acido sialico) e molto stabile. Può essere legata covalentemente alle fasi stazionarie in gel di silice.

\paragraph*{Albumina serica umana} L'HSA (human sieric albumin) è una proteina umana con due regioni di binding distinte, quello
per il warfarin e quello delle benzodiazepine.

\subsubsection{A scambio di ligando}
La cromatografia a scambio di ligando chirale separa gli enantiomeri per formazione di complessi metallici diasteroisomerici.
Sono utilizzate principalmente per la separazione di amminoacidi e sono formate
da un complesso amminoacido-rame legato alla silice o ad un'altra fase stazionaria polimerica.
Poiché il rame lega due amminoacidi uno è quello della fase stazionaria e l'altro,
presente nella fase stazionaria, è quello che sarà sostituito dall'analita, da
cui il nome a  ``scambio di ligando'' \en{Ligand exchange}.

\subsubsection{Eteri corona}
Gli eteri corona sono stati immobilizzati in CSP per la loro capacità di legare
le ammine primarie protonate.
Il campo di applicazione resta limitato.

\subsection{CMPA -- Chiral Mobile Phase Additives}
Gli additivi per fasi mobili chirali consentono di utilizzare colonne non chirali per eseguire HPLC-chirali.
L'utilizzo di colonne classiche permette alte capacità di carico ma comportano il problema di dover rimuovere,
in un secondo tempo, l'additivo aggiunto come selettore di chiralità, il quale, per altro, spesso non ha un costo
tale da renderle economicamente vantaggiose per applicazioni su larga scala.

Esistono diversi tipi di additivi:
\begin{itemize}
	\item coppie ioniche;
	\item complessi d'inclusione;
	\item scambio di ligando;
	\item additivi proteici.
\end{itemize}

\subsubsection{Coppie ioniche}
Possono essere impiegati agenti accoppianti chirali ionici che formino con l'analita coppie diasteroisomeriche
che vengono separate in colonna, ad es.\ il propanololo è stato separato in coppia ionica con acido tartarico.
Il problema è la bassa capacità di carico.

\subsubsection{Complessi di inclusione}
Complessi di inclusione possono essere ottenuti aggiungendo ciclodestrine a fasi mobili acquose.
Le condizioni possono essere ottimizzate su CSP a ciclodestrine, la rimozione è semplice (estrazione acido-base
o colonna reverse-phase).

\subsubsection{Scambio di ligando}
La cromatografia a scambio di ligando può essere eseguita su delle C18 con rame acetato nella fase mobile e con
N-alchil-idrossiprolina come selettore chirale adsorbito sulla fase stazionaria.

\subsubsection{Additivi proteici}
Sia l'albumina serica bovina (BSA) che l'alfa-glicoproteina (AGP) possono essere impiegate, ma la prima da' problemi
con i detector UV e la seconda è costosa.

\subsection{Ottenimento di enantiomeri puri}
Sostanze enantiomericamente pure possono essere ottenute per:
\begin{itemize}
	\item sintesi chirali;
	\item sintesi achirale seguita da risoluzione indiretta;
	\item sintesi achirale seguita da cromatografia.
\end{itemize}

\subsubsection{Sintesi chirale}
La sintesi chirale richiede un prodotto di partenza chirale (o prochirale e catalizzatori chirali)
è complessa e richiede che in nessun passaggio intermedio nelle condizioni di reazione
si possa verificare la racemizzazione del composto.
Ne segue che la purezza chirale va monitorata durante tutta la sintesi con opportune
metodiche analitiche.
I vantaggi sono nel lungo termine: dopo il grande investimento iniziale per la progettazione e
lo sviluppo di una sintesi chirale, infatti, si risparmia non dovendo smaltire l'enantiomero
non desiderato, si possono ottenere quindi rese maggiori a partire dai prodotti di partenza
e lo scale-up è immediato non essendoci fasi di purificazione, più difficilmente scalabili.

\subsubsection{Sintesi achirale seguita da risoluzione indiretta}
La sintesi achirale è più rapida da progettare e generalmente meno costosa della chirale
ma pone il problema dello step risolutivo, il quale può essere difficile e dispendioso in
termini di tempo.
Per la risoluzione si possono utilizzare:
\begin{itemize}
	\item cristallizzazione;
	\item risoluzione cinetica con enzimi;
	\item formazione di sali diasteroisomerici con successiva cristallizzazione.
\end{itemize}

Il problema maggiore di questo approccio è che la fase purificativa è ``single step'', e
pertanto è richiesto un alto grado di enantioselettività nel selettore chirale (al contrario
nelle colonne HPLC chirali la selettività è bassa ma la separazione è multistep).
E' inoltre necessario disporre del selettore di chiralità in elevata purezza per non
compromettere resa e/o purezza del prodotto finale.

\subsubsection{Sintesi achirale seguita da risoluzione cromatografica}
La risoluzione mediante cromatografia può avvenire, a sua volta, in tre modi:
\begin{itemize}
	\item formazione di un derivato diasteroisomerico separato in HPLC classica;
	\item HPLC chirale: fase stazionaria chirale (CSP);
	\item HPLC chirale: additivi di fase mobile chirali (CMPA).
\end{itemize}

\paragraph{Formazione di derivati diasteroisomerici} Questo metodo risente degli
stessi limiti della sintesi achirale seguita da risoluzione indiretta per selettività,
purezza e problemi connessi all'agente derivatizzante.
Si aggiungono poi le problematiche connesse allo sviluppo del metodo cromatografico:
l'unico vero vantaggio è dato dall'utilizzo delle colonne tradizionali.

\esame[28/3/11]{Definire la rotazione specifica, la purezza ottica, l'eccesso enantiomerico
ed elencare le metodiche HPLC per la determinazione della purezza ottica.}
\paragraph{CSP} I vantaggi della CSP sono la separazione rapida e multistep senza bisogno
di derivatizzare il prodotto, ma questo al prezzo di alti costi, basse capacità di carico e
dalla specificità per il singolo processo della colonna usata.

\paragraph{CMPA} I vantaggi dei CMPA sono simili alle CSP ma con una maggior versatilità in
quanto non sono necessarie colonne dedicate, gli additivi sono in genere meno costosi delle
colonne CSP ma è necessario uno step in più per l'allontanamento dell'additivo.

% TO BE DEFINED
\section{Dispersione ottica rotatoria (ORD)}
\label{Dispersione Ottica Rotatoria}
La dispersione ottica rotatoria \en{Optical rotatory dispersion -- ORD} è la variazione della
rotazione ottica di una sostanza in funzione della lunghezza d'onda della luce piano polarizzata
usata nell'analisi.

\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/ORD_monotona.png}
	% ORD_monotona.png: 726x640 pixel, 72dpi, 25.61x22.58 cm, bb=0 0 726 640
	\caption{Fig.: Andamento ORD monotono per diversi composti (derivati terpenici chirali).}
	\label{ORD_monotono}
\end{figure}


In particolare sono possibili due andamenti del potere ottico in funzione della $\lambda$.
Se il composto non presenta assorbimento significativo
nell'UV-VIS l'andamento sarà monotono decrescente, ovvero a lunghezze d'onda maggiori corrisponderà
una rotazione ottica minore.
Se il composto assorbe nell'UV-VIS si può verificare l'effetto Cotton.

\subsection{Effetto Cotton}
\definizione{L'effetto Cotton è quel fenomeno per cui alla lunghezza d'onda alla quale si ha il
picco di assorbanza all'UV corrisponde un potere ottico nullo ed un flesso nella curva ORD.}

Nota che l'inversione del segno per un enantiomero è comunque bilanciata dall'andamento speculare
dell'altro. Uno spettro ORD con effetto Cotton (in un derivato della canfora) è mostrato
in figura \ref{Fig.: ORD_canfora}, si noti l'uguaglianza di segno tra ORD e CD.

\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/ORD_CD_ABS_canfora_SO4.png}
	% ORD_CD_ABS_canfora_SO4.png: 600x388 pixel, 96dpi, 15.87x10.26 cm, bb=0 0 450 291
	\caption{Grafici ORD (verde), CD (rosso) ed UV (blu) per i due enantiomeri dell'acido camfor-sulfonico.
	Si nota l'effetto Cotton.}
	\label{Fig.: ORD_canfora}
    
\end{figure}

Nota che la lunghezza d'onda influisce in modo molto significativo sull'entità della rotazione
ottica di composti otticamente attivi: si tratta del parametro che influisce di più.

\section{Dicroismo circolare}
Il dicroismo circolare \en{Circular Dichroism -- CD} è la differenza dei coefficienti di assorbanza molare di una
sostanza chirale per due raggi di luce circolarmente polarizzata, destrorsa e sinistrorsa,
in funzione della lunghezza d'onda della luce stessa.
\begin{align}
	A_L - A_R &= (\epsilon_L - \epsilon_R) \cdotp l \cdotp c
\end{align}


\subsection{Misurazioni}
In pratica in funzione della lunghezza d'onda della luce piano polarizzata usata, cambia
l'ellitticità della luce trasmessa.
Strumentalmente, però, non si misura l'ellitticità ma l'assorbanza della luce destra,
della sinistra e se ne calcola la differenza.

La differenza nell'assorbanza tra luce polarizzata circolarmente destra e sinistra è
generalmente compresa tra lo $0,03\%$ e lo $0,3\%$ dell'assorbimento totale.

\subsubsection{Unità di misura}
E' pratica comune, per ragioni storiche, esprimere i valori di CD come ellitticità,
la quale può essere ricavata con la seguente formula:
\begin{align}
	\theta &= 2,303 (A_L - A_R) \frac{180}{4\pi} = 32,98 \cdotp \varDelta A
\end{align}

Analogamente, l'ellitticità molare è definita come l'ellitticità corretta per la concentrazione:
\begin{align}
	[\theta] &=  \frac{\theta}{[C] l} = 32,98 \varDelta \epsilon
\end{align}

L'ellitticità non è altro che una diversa unità di misura per la differenza di assorbanza
tra le due componenti della luce piano polarizzata, pertanto gli spettri che riportano
l'andamento dell'ellitticità in funzione della lunghezza d'onda sono spettri CD.

\subsection{Applicazioni}
\subsubsection{Struttura secondaria proteine}
Il dicroismo circolare è particolarmente utile nello studio della struttura secondaria delle
proteine in quanto, entro certi limiti, permette di individuare e riconoscere il tipo di
struttura secondaria assunto in soluzione da una proteina.

Ciò è ottenuto per confronto con reference basis set, ovvero con proteine-esempio
caratterizzate da un'unica struttura secondaria (es.\ poli-Lys che in funzione di pH e T
assume struttura a random coil, $\alpha$-elica o foglietto $\beta$).

Questo è possibile in quanto il legame peptidico presenta due picchi di assorbimento
nell'UV a cui corrispondono spettri CD con andamenti caratteristici in funzione delle
diverse disposizioni assunte dal gruppo ammidico.

Una volta tabulati gli spettri CD delle strutture secondarie principali ($alpha$-elica, $beta$-foglietto etc.)
si può valutare l'entità di ciascuna forma in una proteina in esame mediante deconvoluzione, ovvero
stimando mediante calcolo assistito al computer la componente di ciascuna forma nel determinare
lo spettro osservato. Ciò è possibile per l'additività delle curve CD dei vari legami peptidici.

Un esempio di una serie di spettri CD di proteine con tenore crescente di alfa elica nella loro
struttura secondaria è illustrato in figura \ref{Fig.:CD_alpha_helix}.
\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=10cm]{./img/CD_alpha_helix.jpg}
	% CD_alpha_helix.jpg: 444x338 pixel, 113dpi, 9.98x7.60 cm, bb=0 0 283 215
	\caption{Andamento degli spettri CD per una serie (0-50) di proteine con
	contenuti crescenti di struttura secondaria ad alfa-elica (grafico in alto a destra).
	Si nota come proteine con alti tassi della stessa struttura secondaria
	(alfa-elica in questo caso) abbiano spettri CD siano comparabili.}
	\label{Fig.:CD_alpha_helix}
\end{figure}

\paragraph{Attendibilità} Nota che il risultato ottenuto dalla previsione della struttura
secondaria mediante spettri CD non è sempre accurato, ma dipende molto dalle proteine
scelte come ``modello'' per calibrare la deconvoluzione.
Il confronto con valori ``veri'' può essere fatto per proteine delle quali sia nota
la struttura ai raggi-X (XRD), tenendo conto che le differenze possono anche derivare
dalla diversa conformazione assunta dalla proteina in soluzione rispetto alle condizioni cristalline.
Infine, anche se gli spettri CD possono fornire informazioni sulla composizione di
strutture secondarie presenti non ci dicono in che punto della sequenza siano localizzate
queste strutture.

\subsection{Folding ed unfolding proteico}
Il folding proteico è il ripiegamento dalla forma lineare alla conformazione nativa
di una proteina. In vivo, ed in condizioni idonee anche in vitro, è un processo rapido ed efficiente.

Lo studio del folding proteico è importante per la biologia (per prevedere la struttura
tridimensionale a partire dalla sequenza amminoacidica), per la tecnica farmaceutica
(spesso la formazione di aggregati in farmaci contenenti proteine ricombinanti è un problema
grave\footnote{Tanto più grave se si ricorda come i farmaci formati da proteine non
siano assorbiti per os, e pertanto sia necessaria l'iniezione parenterale. La siringability
della proteina diventa quindi cruciale e la formazione di aggregati la può compromettere.})
ed in clinica (per patologie più o meno direttamente correlate al folding proteico,
sopratutto a livello del SNC).

\subsubsection{Analisi dell'unfolding proteico}
La denaturazione proteica può essere indotta per riscaldamento o mediante l'utilizzo di agenti
denaturanti (es.\ urea).

\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/CD_unfolding.png}
	% CD_unfolding.png: 440x409 pixel, 72dpi, 15.52x14.43 cm, bb=0 0 440 409
	\caption{Andamento dello spettro CD in funzione della temperatura ($0-80\celsius$).}
	\label{Fig.:CD_temp_unfold}
\end{figure}


La progressiva denaturazione può essere seguita al dicrografo (vedi fig.\ \ref{Fig.:CD_temp_unfold}),
si ottengono così parametri (come la concentrazione di denaturante o la temperatura alla quale
il 50\% della proteina è denaturato) che permettono di valutare la stabilità della proteina
in diverse condizioni operative (solventi, processi produttivi etc.).

\subsection{Dicrografo}
Lo strumento che misura gli spettri di dicroismo circolare è il dicrografo o spettropolarimetro
CD.

\begin{figure}[ht!]
	\centering
	\includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/CD_schema.png}
	% CD_schema.png: 461x323 pixel, 72dpi, 16.26x11.39 cm, bb=0 0 461 323
	\caption{Schema di un dicrografo.}
	\label{Fig.:CD_apparatus}
\end{figure}

\esame[28/7/11]{Dicroismo circolare. Definire il dicroismo circolare, illustrare come
viene misurato e le informazioni strutturali che fornisce questa tecnica.}
Un dicrografo (fig.\ \ref{Fig.:CD_apparatus}) è formato da una sorgente di luce piano
polarizzata a lunghezza d'onda regolabile (ovvero una sorgente di luce seguita da
un monocromatore a $\lambda$ variabile  ed un polarizzatore) seguito da un modulatore
fotoelastico (un apparato che seleziona alternativamente la sola componente circolarmente
polarizzata destra o sinistra) una cella contenente il campione, un fotomoltiplicatore
che funge da rilevatore e permette di aumentare la sensibilità dello strumento,
ed infine un computer che integra le informazioni fornendo lo spettro CD.

\subsection{CD in Farmacopea}
Al dicroismo circolare è dedicata una monografia della Farmacopea Europea,
nella sezione 2 dedicata ai metodi analitici.

\begin{PhEur}[CIRCULAR DICHROISM]{2.2.41}
The difference in absorbance of optically active substances
within an absorption band for left and right circularly
polarised light is referred to as circular dichroism.

Direct measurement gives a mean algebraic value:
\begin{align*}
    \varDelta A = A_L - A _R
\end{align*}
\begin{align*}
\varDelta A &= \text{circular dichroic absorbance,}&\\
A_L &= \text{absorbance of left circularly polarised light,}&\\
A_R &= \text{absorbance of right circularly polarised light.}&
\end{align*}

Circular dichroism is calculated using the equation:
\begin{align*}
    \varDelta \epsilon = \epsilon_L - \epsilon_R = \frac{\varDelta A}{c * l}
\end{align*}

\begin{align*}
\varDelta \epsilon &= \text{molar circular dichroism or molar differential
dichroic absorptivity}&\\
& \text{expressed in \si{\litre \per \mole \centi \meter},}&\\
\epsilon_L &= \text{molar absorptivity (2.2.25) of left circularly polarised light,}&\\
\epsilon_R &= \text{molar absorptivity of right circularly polarised light,}&\\
c &= \text{concentration of the test solution in \si{\mole \per \litre},}&\\
l &= \text{optical path of the cell in centimetres.}&
\end{align*}

The following units may also be used to characterise circular
dichroism:

\emph{Dissymmetry factor:}
\begin{align*}
	g = \frac{\varDelta \epsilon}{\epsilon}
\end{align*}
\begin{align*}
\epsilon &= \text{molar absorptivity (2.2.25).}&
\end{align*}

\emph{Molar ellipticity:}
Certain types of instruments display directly the value of
ellipticity $\Theta$, expressed in degrees. When such instruments
are used, the molar ellipticity [$\Theta$] may be calculated using
the following equation:
\begin{align*}
	[\Theta] &= \frac{\Theta * M}{c * l * 10}
\end{align*}
\begin{align*}
[\Theta]&= \text{molar ellipticity, expressed in degrees $\cdotp \cm^2 \cdotp \text{decimole}^{-1}$}&\\
\Theta	&= \text{value of ellipticity given by the instrument,}&\\
M 	&= \text{relative molecular mass of the substance to be examined,}&\\
c 	&= \text{concentration of the solution to be examined in g/ml,}&\\
l 	&= \text{optical path of the cell in centimetres.}&\\
\end{align*}
Molar ellipticity is also related to molar circular dichroism by the following equation:
\begin{align*}
	[\Theta] &= 2.303 \varDelta \epsilon \frac{4500}{\pi} \approx 3300 \varDelta \epsilon
\end{align*}

Molar ellipticity is often used in the analysis of proteins
and nucleic acids. In this case, molar concentration is
expressed in terms of monomeric residue, calculated using
the expression:
\begin{align*}
	    \frac{\text{molecular mass}}{\text{numer of amino acids}}
\end{align*}

The mean relative molecular mass of the monomeric residue
is $100$ to $120$ (generally $115$) for proteins and about $330$ for
nucleic acids (as the sodium salt).

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/Ph_eur_cd.png}
 % Ph_eur_cd.png: 680x299 pixel, 96dpi, 17.99x7.91 cm, bb=0 0 510 224
 \caption{Optical scheme of a dichrograph}
 \label{Fig.:PH_EUR_CD}
\end{figure}


\paragraph*{Apparatus} The light source (S) is a xenon lamp
(Figure \ref{Fig.:PH_EUR_CD}); the light passes through a double
monochromator (M) equipped with quartz prisms (P1, P2).

The linear beam from the first monochromator is split
into 2 components polarised at right angles in the second
monochromator. The exit slit of the monochromator
eliminates the extraordinary beam.

The polarised and monochromatic light passes through
a birefringent modulator (Cr): the result is alternating
circularly polarised light.

The beam then passes through the sample to be examined (C)
and reaches a photomultiplier (PM) followed by an amplifier
circuit which produces 2 electrical signals: one is a direct
current $\text{V}_c$ and the other is an alternating current at the
modulation frequency $\text{V}_{ac}$ characteristic of the sample to be
examined. The phase gives the sign of the circular dichroism.

The ratio $\text{V}_{ac}$/$\text{V}_c$ is proportional to the differential absorption
$\varDelta A$ which created the signal. The region of wavelengths
normally covered by a dichrograph is $170 \nm$ to $800 \nm$.

\paragraph*{Calibration of the apparatus}
\emph{Accuracy of absorbance scale.} Dissolve $10.0 \mg$ of
\emph{isoandrosterone R} in \emph{dioxan R} and dilute to $10.0 \ml$ with
the same solvent. Record the circular dichroism spectrum of
the solution between $280 \nm$ and $360 \nm$. Measured at the
maximum at $304 \nm$, $\varDelta \epsilon$ is $+3.3$.

The solution of \emph{(1S)-(+)-10-cam\-phor\-sul\-phonic acid R} may
also be used.

\emph{Linearity of modulation.} Dissolve $10.0 \mg$ of
\emph{(1S)-\-(+)-\-10\--cam\-phor\-sul\-pho\-nic acid R} in \emph{water R} and dilute
to $10.0 \ml$ with the same solvent. Determine the exact
concentration of camphorsulphonic acid in the solution by
ultraviolet spectrophotometry (2.2.25), taking the specific
absorbance to be $1.49$ at $285 \nm$.

Record the circular dichroism spectrum between $185 \nm$
and $340 \nm$. Measured at the maximum at $290.5 \nm$,  $\varDelta \epsilon$
is $+2.2$ to $+2.5$. Measured at the maximum at $192.5 \nm$,
$\varDelta \epsilon$ is $-4.3$ to $-5$.

\emph{(1S)-(+)- or antipodal (1R)-(–)-ammonium
10-camphorsulphonate R} can also be used.
\end{PhEur}


\section{Rifrattometria}
\label{Rifrattometria}
\subsection{Indice di rifrazione}
\definizione{La rifrattometria è una metodica analitica che utilizza un rifrattometro,
ovvero lo strumento capace di misurare l'indice di rifrazione ($n$) di una sostanza.}

L'indice di rifrazione è per i liquidi l'analogo del punto di fusione per i solidi.
Esso può essere definito come il rapporto tra la velocità della luce nel vuoto ($c$)
e la velocità di propagazione della luce nel mezzo, e come tale è un  numero adimensionale.
\begin{align}
	n_x &= \frac{c}{\vec {v_x}} \label{Indice rifrazione n, definizione}
\end{align}
L'indice di rifrazione dipende dalla temperatura del campione e dalla lunghezza d'onda
della luce utilizzata.

La rifrattometria può essere usata per l'identificazione, l'analisi della purezza
o della concentrazione di sostanze liquide.

Ogni volta che la luce attraversa il confine tra un mezzo e l'altro e la sua velocità cambia
si verifica rifrazione. Se il raggio incidente non è perpendicolare alla superficie di
separazione tra i due mezzi il raggio rifratto cambia inclinazione secondo la legge:
\begin{align}
	\frac{v_A}{v_B} &= \frac{\sin \theta_A}{\sin \theta_B} = \frac{n_B}{n_A}
\end{align}
dove i pedici $A$ e $B$ indicano i due mezzi attraverso i quali diffonde il raggio luminoso.

\subsection{Il rifrattometro di Abbe}
\esame[31/1/11]{Definire l'indice di rifrazione ed illustrare il principio di funzionamento
del rifrattometro di Abbe.}
Il rifrattometro di Abbe è un rifrattometro, ovvero uno strumento per la misurazione degli
indici di rifrazione, costituito da due prismi ad alto indice di rifrazione, il primo illuminante
ed il secondo rifrangente, tra i quali è posta la sostanza di cui si vuole misurare l'$n$.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/Abbe.png}
 % Abbe.png: 558x302 pixel, 301dpi, 4.72x2.55 cm, bb=0 0 134 72
 \caption{Schema di un rifrattometro di Abbe}
 \label{Fig.:Abbe}
\end{figure}


In figura \ref{Fig.:Abbe} è riportato lo schema di funzionamento di un rifrattometro di Abbe.
$1$ e $2$ sono i due prismi, rispettivamente illuminante e rifrangente. La luce (frecce blu)
entra dall'unica faccia non annerita del prisma illuminante. Risulta chiaro, osservando
un po' la figura, che il raggio $AC$ è quello che penetra il prisma $2$ con l'angolo maggiore
rispetto alla normale ($\theta_1$).
Poiché il prisma 2 è di un materiale con alto indice di rifrazione il raggio rifratto avrà
formerà un angolo $\theta_2$ con la normale minore\footnote{Un limite del rifrattometro di Abbe,
infatti, è la possibilità di misurare solo sostanze con indice di rifrazione inferiore a quello
del prisma, che è generalmente di circa $1,7$.
Si tratta in realtà di un valore molto elevato per gli usi comuni, e non costituisce un problema;
molto più importante nella pratica è l'impossibilità di utilizzare liquidi o soluzioni che possano
intaccare chimicamente il prisma stesso.}.
Da quanto detto risulta chiaro che il raggio di luce che andrà ``più lontano'' lungo l'asse
inferiore ($x_1 - x_2$) sarà quello tracciato in blu fino al punto E. Pertanto sarà illuminata
solo la porzione $x_1 - E$ mentre la parte $E - x_2$ sarà buia. Dalla posizione di E è poi
possibile calcolare l'indice di rifrazione del campione essendo noto quello del prisma inferiore.

Matematicamente:
\begin{displaymath}
\begin{aligned}
	\frac{\sin \theta_1}{\sin \theta 2} = \frac{n_2}{n_{campione}} \\
	\theta_2 = \tan^{-1} \left( \frac{DE}{CD} \right) \\
	\theta_1 = \tan^{-1} \left( \frac{BC}{AB} \right) \\
	n_{campione} = \frac{\sin \theta 2 \cdotp n_2}{\sin \theta_1}
\end{aligned}
\end{displaymath}

\subsubsection{Effetto della lunghezza d'onda}
Il problema di tale modello è che è necessario utilizzare luce monocromatica in quanto
l'indice di rifrazione dipende significativamente dalla lunghezza d'onda\footnote{Ciò
spiega la scomposizione della luce visibile bianca nelle componenti, il cosiddetto
arcobaleno, da parte dei prismi di rifrazione. In particolare le lunghezze d'onda minori
hanno indici di rifrazione maggiori.} o, in alternativa, si possono aggiungere dei
prismi di correzione che annullino l'effetto della lunghezza d'onda e restituiscano
valori equivalenti a quelli che si sarebbero trovati utilizzando come sorgente di
luce monocromatica la linea D del sodio ($589$\si{\nm}), anche in questo caso adottata come standard.

\subsubsection{Effetto della temperatura}
L'altro parametro che può inficiare le misure di rifrattometria è la temperatura (del campione
e, in misura minore, del prisma rifrangente). L'indice di rifrazione, infatti, dipende dalla
temperatura ($\approx - 0,0005$\si{\per \celsius}).
Ciò non stupisce se si ricorda come il fenomeno della rifrazione dipenda dalla minor
velocità della luce nel mezzo: poiché all'aumentare della temperatura la densità
dei liquidi abitualmente diminuisce, allo stesso modo diminuisce la velocità della luce
nel mezzo, che come è intuitivo dipende dalla densità.

\subsection{Farmacopea}
L'indice di rifrazione è inserito nei metodi d'analisi della Farmacopea Europea.

\begin{PhEur}[ REFRACTIVE INDEX]{2.2.6}
The refractive index of a medium with reference to air is
equal to the ratio of the sine of the angle of incidence of a
beam of light in air to the sine of the angle of refraction of
the refracted beam in the given medium.

Unless otherwise prescribed, the refractive index is measured
at $20 \pm 0.5 \celsius$, with reference to the wavelength of the D-line
of sodium ($\lambda = 589.3 \nm$); the symbol is then $n_D^{20}$.

Refractometers normally determine the critical angle. In
such apparatus the essential part is a prism of known
refractive index in contact with the liquid to be examined.

Calibrate the apparatus using certified reference materials.

When white light is used, the refractometer is provided
with a compensating system. The apparatus gives readings
accurate to at least the third decimal place and is provided
with a means of operation at the temperature prescribed.
The thermometer is graduated at intervals of $0.5 \celsius$ or less.
\end{PhEur}


\section{Diffusione luce}
I fenomeni diffusivi, o di ``scattering'', derivano da un'interazione diversa rispetto a
riflessione e rifrazione tra la luce ed una superficie, e sono responsabili della diffusione
della luce in tutte le direzioni a partire dal punto di contatto con la superficie.

L'intensità della luce diffusa è proporzionale alla quarta potenza della frequenza,
ovvero inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda e quindi le lunghezze d'onda
minori sono quelle più diffuse.
Per questo il cielo è azzurro, perché la luce blu-viola è quella con lunghezza d'onda minore
nel visibile ed è quindi quella più diffusa tra le radiazioni percepite dall'occhio umano\footnote{In
particolare poi il cielo è azzurro e non viola perché l'occhio ha più fotorecettori retinici per il blu
che per il viola e perché il sole emana un'intensità maggiore di luce blu rispetto alla viola.}.
Parallelamente il sole ci appare giallo e non bianco perché privato della componente
blu, più diffusa.
Quando, come all'alba o al tramonto, la luce solare deve attraversare più strati di atmosfera,
viene più diffusa e le uniche lunghezze d'onda che ci arrivano sono quelle rosse-arancio,
a maggiore lunghezza d'onda nel visibile.

La diffusione può avvenire a livello molecolare, o a livello particellare, quando le particelle
hanno dimensioni minori o uguali alla lunghezza d'onda ($\lambda$) della luce incidente, e si
trovano in un mezzo con indice di rifrazione $n$ molto diverso dal proprio.

In particolare si possono distinguere i seguenti casi:\\
\textbf{se la lunghezza d'onda emessa è uguale a quella incidente}
\begin{itemize}
    \item diffusione di Rayleigh;
    \item diffusione di Mie (o effetto Tyndall).
\end{itemize}
\textbf{se la lunghezza d'onda emessa è diversa da quella incidente}
\begin{itemize}
    \item diffusione Raman.
\end{itemize}

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=5cm,keepaspectratio=true]{./img/Tyndall_Mie_latte.jpg}
 % Tyndall_Mie_latte.jpg: 800x480 pixel, 72dpi, 28.22x16.93 cm, bb=0 0 800 480
 \caption{Fenomeni diffusivi in un bicchiere di latte (un sistema colloidale).
	Le lunghezze d'onda minori (blu viola) sono più diffuse (come si nota dal
	colore blu dell'alone attorno al raggio) il che provoca un viraggio al giallo
	della luce trasmessa.
	E' stata usata una sorgente LED bianca con un bicchiere di latte diluito opportunamente.}
 \label{Fig.:Latte_diffusione}
\end{figure}


\subsection{Diffusione di Rayleigh}
La diffusione (o ``scattering'') di Rayleigh è provocato da particelle di dimensioni
minori di $1/20$ rispetto a quelle della lunghezza d'onda incidente per particelle immerse
in un mezzo trasparente, sia esso solido, liquido o gassoso.

Dalla legge di Rayleigh, che esprime l'intensità del fenomeno, si ricava la distribuzione
angolare nello spazio della luce diffusa (che è bilobata) e si può osservare la dipendenza dalla quarta
potenza della frequenza e, soprattutto, la proporzionalità con il numero di particelle
responsabili dello scattering.
Questo ultimo fattore è cruciale per le applicazioni analitiche che può trovare la diffusione
(ovvero nefelometria e turbidimetria).

\begin{figure}[!htb]
 \centering
 \includegraphics[width=5cm,keepaspectratio=true]{./img/blue_sky.png}
 \caption{Per una spiegazione esaustiva sul perchè il cielo non sia viola si veda \href{http://math.ucr.edu/home/baez/physics/General/BlueSky/blue_sky.html}{questa} pagina. [Immagine da \href{http://xkcd.com/1145/}{XKCD}}
 \label{Fig.:Sky_xkcd}
\end{figure}

\subsection{Diffusione di Mie}
La diffusione di Mie (o effetto Tyndall) si verifica quando le particelle disperse hanno
dimensioni paragonabili a quelle della lunghezza d'onda incidente. Ciò si osserva di
frequente nei colloidi in quanto le particelle colloidali, per definizione, hanno dimensioni
comprese tra $10^{-9}$ e $10^{-6}$ \meter , mentre la luce visibile  $400$ -- $700$\si{\nm}.
La diffusione di Mie è diversa da quella di Rayleigh per la legge che la regola.
In particolare la dipendenza in questo caso è con la seconda potenza della frequenza, e
non con la quarta, e la forma della distribuzione angolare della luce diffusa 
in questo caso è, sempre bilobata, ma asimmetrica, e maggiore nella direzione
di propagazione del fascio luminoso che genera diffusione.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=7cm,keepaspectratio=true]{./img/Tyndall.jpg}
 % Tyndall.jpg: 640x480 pixel, 72dpi, 22.58x16.93 cm, bb=0 0 640 480
 \caption{Diffusione della luce da parte di particelle d'acqua di dimensioni comparabili
	a quelle della lunghezza d'onda della luce visibile per effetto Tyndall.}
 \label{Fig.:Tyndall_img}
\end{figure}

\subsection{Nefelometria e turbidimetria}
Nefelometria e turbidimetria sono due tecniche per la misurazione dei fenomeni diffusivi,
e come tali possono essere utilizzate per calcolare la quantità di di particelle
di determinate dimensioni presenti in un campione ed, eventualmente, anche all'interno
di corpi trasparenti o semitrasparenti, previa normalizzazione della luce diffusa
dal solo contenitore.

Entrambi gli strumenti (ma in genere lo stesso strumento può effettuare sia misure
nefelometriche sia turbidimetriche, a seconda di come viene impostato) sono formati da:
\begin{itemize}
 \item una sorgente di luce;
 \item un selettore d lunghezze d'onda per rendere la luce incidente monocromatica\footnote{Si
    ricorda la grande dipendenza della diffusione dalla lunghezza d'onda!};
 \item il campione da analizzare;
 \item un detector ed un elaboratore del segnale.
\end{itemize}

La differenza tecnica tra le due è che mentre la turbidimetria misura la luce diffusa
``in avanti'', ovvero lungo la direzione della radiazione incidente, la nefelometria
misura la luce diffusa a $90\degree$ rispetto al raggio incidente.


\paragraph{Nefelometria} Per la nefelometria si ha che:
\begin{align}
	I_d &= I_0 \cdotp k \cdotp N
\end{align}
dove $I_d$ è l'intensità di luce diffusa (il segnale registrato) che dipende dalla luce
incidente ($I_0$) per il numero di particelle che diffondono ($N$) a meno di una costante
($k$).

\paragraph{Turbidimetria} Per la turbidimetria, invece, si ha:
\begin{align}
	T &= k \cdot b \cdotp C
\end{align}
dove $T$, la turbidanza (che è il $\log I_0 / I_d$) dipende dalla concentrazione
delle particelle che diffondono ($C$) per $b$ che è la
lunghezza del cammino ottico a meno di una costante ($k$)\footnote{
Si noti l'analogia tra questa espressione e la Lambert-Beer.}.
Se si integra $I_0$ in $k$ si ottiene la versione fornita dalle slide:
\begin{align}
	T &= \log I_0 / I_d = - \log I_d = k \cdot b \cdotp C
\end{align}

\subsection{Turbidimetria o nefelometria?}
La scelta su quale tecnica d'analisi utilizzare dipende dalle condizioni.
Nel caso si stia analizzando un campione che diffonde poco la luce, la turbidimetria
non sarà adeguata in quanto gran parte della luce sarà riflessa e l'intensità di luce
misurata lungo il cammino ottico dal turbidimetro sarà simile all'intensità della
luce incidente.
La sensibilità dell'analisi turbidimetrica in questo caso risulta molto basse, ma si
potranno ottenere buoni risultati con la nefelometria che va a misurare solo la porzione
di luce diffusa, ed è sensibile e precisa anche (e soprattutto) a basse concentrazioni.
Le due tecniche risultano quindi complementari.

\esame[28/11/11]{Nefelometria e Turbidimetria. Illustrare queste due tecniche, in cosa
differiscono e le diverse applicazioni.}
Un altro parametro da considerare nella scelta della tecnica analitica sono le dimensioni
delle particelle disperse. Questo fattore è particolarmente importante per la nefelometria
in quanto la luce diffusa a $90$\degree è maggiore nel caso della dello scattering di Rayleigh
rispetto alla Mye, pertanto si otterranno risultati migliori con particelle più piccole.

\subsubsection{Nefelometria in immunochimica}
Un'interessante applicazione della nefelometria è il dosaggio di complessi anti\-gene-\-anti\-corpo
o farmaco-proteina in sieri umani.
Dopo aver isolato la frazione d'interesse, infatti, la si dosa con lo scattering ed
effettuando misure di turbidimetria.

\subsubsection{Diffusione in Farmacopea}
Nefelometria e turidimetria sono iscritte in farmacopea (FUI XII) come metodiche strumentali
per la misurazione della limpidezza e del grado di opalescenza dei liquidi.

\begin{FUIXII}[Limpidezza e grado di opalescenza dei liquidi]{2.2.1}
\ %That's an horrible hack to overdue an unexplanable latex limitation: can't begin with \paragraph -.-''
\paragraph*{Nefelometria}
Quando una sospensione viene esaminata perpendicolarmente alla direzione della luce incidente,
il sistema appare opalescente a causa della riflessione
della luce sulle particelle della sospensione (effetto Tyndall).
Una certa parte del raggio di luce che attraversa un liquido torbido viene trasmessa,
un'altra parte viene assorbita e la rimanente parte viene diffusa dalle particelle sospese.
Se la misurazione viene effettuata a $90\degree$ rispetto al raggio di luce,
la luce diffusa dalle particelle sospese può essere utilizzata per la determinazione della loro concentrazione,
a condizione che il numero e le dimensioni delle particelle che influenzano la diffusione rimangano costanti.
Le sospensioni di riferimento devono presentare un grado di torbidità costante e devono
essere preparate nelle stesse condizioni del campione da analizzare.
L'effetto Tyndall dipende sia dal numero delle particelle che dalle loro dimensioni.
Le misurazioni nefelometriche sono più affidabili a valori più bassi di torbidità,
dove vi è una relazione lineare tra i valori di torbidità espressi in Unita di
Torbidità Nefelometrica (UTN) ed i relativi segnali provenienti dal rivelatore.
Con l'aumentare del grado di torbidità, non tutte le particelle sono esposte alla
luce incidente e inoltre la radiazione diffusa dalle altre particelle e ostacolata
nel tragitto verso il rivelatore.
I valori nefelometrici più alti a cui possono essere effettuate misurazioni
affidabili sono dell'ordine di $1750$-$2000$ UTN.
La linearità deve essere dimostrata costruendo una curva di calibrazione a
partire da almeno $4$ concentrazioni.

\paragraph*{Turbidimetria}
La torbidità esprime la proprietà ottica che fa sì che, a seguito della interazione
tra la luce e le particelle in sospensione in un liquido, la luce viene diffusa e
assorbita più che trasmessa in linea retta attraverso il campione.
La quantità di materiale solido in sospensione può essere determinata mediante la
misurazione della luce trasmessa.
Si ottiene una relazione lineare tra la torbidità e la concentrazione
quando le dimensioni delle particelle nella sospensione sono uniformi ed omogenee.
Questo avviene solo nelle sospensioni altamente diluite contenenti
particelle di piccole dimensioni.
La linearità tra la torbidità e la concentrazione deve essere stabilita
costruendo una curva di calibrazione a partire da almeno $4$ concentrazioni.
\end{FUIXII}
[\emph{Si tratta di una monografia armonizzata presente anche in Ph.Eur.\ ($2.2.1$)
revisione $01/2008:20201$.}]

Inoltre la nefelometria è citata come strumento analitico a supporto dei metodi
di immunoprecipitazione.

\begin{FUIXII}[DOSAGGI BIOLOGICI - Metodi immunochimci - Metodi di immunoprecipitazione]{2.7.1}
\ %That's an horrible hack to overdue an unexplanable latex limitation: can't begin with \paragraph -.-''
\paragraph*{Metodi di immunoprecipitazione}
L'immunoprecipitazione può essere valutata visivamente o mediante tecniche di diffusione della
luce (dosaggio per nefelometria o turbidimetria).
Un aumento di sensibilità può essere ottenuto usando come reattivi particelle
rivestite di antigene o di anticorpo (per es.\ il lattice).
\end{FUIXII}

Infine la turbidimetria viene considerata anche tra i ``Metodi alternativi per il
controllo della qualità microbiologica'' (2-1-1-6).

\section{Spettroscopia Raman}
Come detto nell'introduzione sulla diffusione non sempre la luce viene diffusa con la stessa
lunghezza d'onda (e quindi energia) della luce incidente.
Una piccola percentuale della luce diffusa, infatti, presenta una lunghezza d'onda diversa.
\begin{align}
    \lambda_{incidente} &\neq \lambda_{diffusa} \rightarrow E_{incidente} \neq E_{diffusa}
\end{align}
Alla diversa lunghezza d'onda corrisponde una diversa frequenza ($c = \lambda / \nu$)
e quindi una diversa energia ($E = h \cdotp \nu$).

\subsection{Basi teoriche}
In particolare la diffusione di Rayleigh avviene per un'interazione elastica (non c'è
variazione di energia) transiente in cui il fotone è assorbito ed immediatamente riemesso,
mentre la diffusione Raman è anelastica e può essere di Stoke o anti-Stoke.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=12cm,keepaspectratio=true]{./img/Raman_schema.jpg}
 % Raman_schema.jpg: 640x395 pixel, 96dpi, 16.93x10.45 cm, bb=0 0 480 296
 \caption{Schema dei livelli energetici di una molecola ed interazioni con la luce:
    effetti  Raman e Rayleigh.}
 \label{Fig.:Raman_schema}
\end{figure}



\paragraph{Stokes} In figura \ref{Fig.:Raman_schema} è rappresentato lo schema dei livelli energetici di
una molecola sottoposta a spettroscopia Raman.
A temperatura ambiente la maggior parte delle molecole sarà nello stato di riposo $0$,
e pertanto la radiazione luminosa le ecciterà da $0$ ad uno stato di energia ``virtuale''.
Se la molecola si rilassa tornando allo stato fondamentale non c'è effetto Raman, ma Rayleigh,
se invece la molecola si rilassa su uno stato di energia eccitato (es. $1$) si ha l'effetto
Raman-Stokes. Il fotone riemesso avrà in questo caso un'energia (ed una frequenza)
minori rispetto a quello incidente.

\paragraph{Anti-Stokes} Al contrario se la radiazione colpisce una molecola nello stato eccitato ($1$), che è
percentualmente popolato diversamente in funzione della temperatura secondo l'equazione
di Boltzmann, l'energia fornita la eccita ad uno stato di energia virtuale maggiore.
Dallo stato ad energia virtuale la molecola può rilassarsi tornando allo stato fondamentale
(più probabile) emettendo un fotone in questo caso con energia maggiore di quello incidente,
oppure può dare Rayleigh (estremamente poco probabile) tornando allo stato eccitato.
In questo caso si ha l'effetto anti-Stokes.

La spettroscopia Raman fornisce spettri complementari rispetto a quelli IR in quanto se all'IR
è necessario che vi sia un momento di dipolo nel legame eccitato perché possa essere
visibile, e pertanto legami fortemente polarizzati danno segnali più forti (es.\ il
segnale del carbonile a $1700$ \si{\per \cm}), al contrario in Raman sono più visibili
i fenomeni che riguardano legami non polari (come il backbone C-C) mentre sostanze
estremamente polari, come l'acqua, sono pressoché trasparenti.

\paragraph*{Vantaggi}
Quest'ultimo fatto consente di registrare spettri Raman anche in soluzione, e non dover
preparare il campione è un grande vantaggio della Raman sull'IR.
Ciò costituisce uno dei vantaggi della spettroscopia Raman, assieme alla capacità di
penetrare contenitori in plastica o vetro per poter effettuare analisi sul prodotto
finito, oppure è possibile dosare il contenuto in principio attivo in una compressa
sottraendo dallo spettro dell'intera forma farmaceutica quello del rivestimento e
confrontandolo con quello dell'attivo puro.

\paragraph*{Svantaggi}
Tra gli svantaggi della Raman c'è la sua bassa intensità, che rende necessario
l'uso di fonti di luce molto potenti (es.\ raggi laser) inoltre la presenza di fenomeni
di fluorescenza può comportar	e un disturbo significativo alle analisi\footnote{Un
metodo per aumentare il segnale Raman è la surface-enhanced Raman scattering (SERS)
dove l'intensità può essere incrementata fino a $10^6$ grazie alla concentrazione di
locale di densità di carica su superfici opache. Non tutte le superfici, però,
sono idonee ad analisi SERS (es.\ non lo sono le facce di cristalli), si possono
però ``creare'' superfici per sfruttare questo fenomeno adsorbendo l'analita su
particelle metalliche di dimensioni colloidali d'oro o argento\dots}.

Nota che trattandosi di un fenomeno diffusivo la radiazione riemessa è misurata
a 90° rispetto al raggio incidente, come in nefelometria.

\subsection{Microscopia Raman}
\esame[28/7/11]{Spettroscopia Raman: illustrare l'effetto Raman e le applicazioni
 nella chimica farmaceutica.}
Così come si è sviuppata la microscopia IR, che consente di identificare chimicamente
le sostanze osservate al microscopio ottico (e che trova applicazioni, ad esempio,
nei laboratorio di tecnica farmaceutica per lo studio, tra le altre cose, della
distribuzione dei componenti in un semisolido) allo stesso modo si è sviluppato
l'imaging Raman.

Con la microscopia Raman si possono ottenere immagini in cui un pixel corrisponde ad
una cella di 9\si{\micro \meter}.

\section[Spettroscopia XRD]{Sperttroscopia a raggi X (XRD)}
\label{XRD}
La spettroscopia XRD \en{X-Ray Diffraction} o Spettroscopia a raggi-X è la tecnica analitica
più potente per determinare la struttura tridimensionale di un composto noto o incognito.
Il suo limite maggiore è che può essere condotta solo su cristalli, pertanto è necessario
riuscire ad ottenere un cristallo della sostanza di cui si vuole studiare la struttura.

\subsection{Interferenza e diffrazione}
Le basi di ottica su cui si basa l'XRD sono sostanzialmente interferenza e diffrazione.

\subsubsection{Diffrazione}
La diffrazione è un fenomeno che si verifica quando un fascio di luce attraversa una
fenditura avente dimensioni simili alla propria lunghezza d'onda.
Quando questo avviene la fenditura si comporta da nuova sorgente di irradiazione, ovvero
il raggio passante ``devia'' e si propaga in tutte le direzioni.

Ciò può essere spiegato ricorrendo al principio di indeterminazione di Heisenberg, per
il quale esistono coppie di grandezze che non possono essere misurate con previsione
contemporaneamente (ad es.\ posizione e velocità degli elettroni attorno al nucleo).
Per il fotone, infatti, non possono essere note contemporaneamente posizione e direzione:
tanto più si determina la posizione, mediante fenditure più strette, tante meno
informazioni si hanno sulla direzione.

\subsection{Interferenza}
L'interferenza è data dall'interazione tra due onde elettromagnetiche e può essere
costruttiva se sono in fase, nel qual caso le loro intensità si sommano, o distruttiva
se sono fuori-fase, ed in questo caso si annullano.

\subsubsection{Interferenza e diffrazione}
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/XRD_Interferogramma.png}
 % XRD_Interferogramma.png: 293x194 pixel, 96dpi, 7.75x5.13 cm, bb=0 0 220 145
 \caption{Interferogrammma prodotto dalla sovrapposizione di due onde.}
 \label{Fig.:XRD_interferogramma}
\end{figure}

Una celebre evidenza sperimentale dei fenomeni di interferenza e diffrazione è data
dall'esperimento di Young, illustrato in figura \ref{Fig.:XRD_YOUNG}.
Un raggio  luminoso viene fatto passare attraverso una fenditura di dimensioni tali
da provocare diffrazione, quindi è interposto un ulteriore schermo con due fenditure
vicine tra loro (sempre nell'ordine di grandezza della $\lambda$) ma su un cammino ottico
diverso da quello del raggio incidente il primo schermo.
Per permettere alla luce il passaggio attraverso queste due fenditure è necessario che
si verifichi diffrazione, altrimenti, se la luce proseguisse in linea retta dopo aver
oltrepassato la prima fenditura, non si vedrebbe nessun raggio luminoso uscente.

I fasci di luce che oltrepassano le due fenditure vengono quindi fermati da una lastra
fotografica posta ad un'adeguata distanza dal secondo schermo.
Si leggerà sulla lastra un interferogramma analogo a quello in figura \ref{Fig.:XRD_interferogramma}
ovvero alternanza di linee di luce e linee  di buio.
Questo perché le due fenditure si comportano come due nuove sorgenti e, a seconda
della posizioni le due onde avranno percorso distanze diverse pertanto, essendo in fase
all'origine potrebbero non esserlo più.
Dove l'interferenza è costruttiva si leggono linee chiare sulla lastra fotografica, dove
l'interferenza è distruttiva si trovano le linee scure.
E' possibile una trattazione matematica del fenomeno che permette di individuare le
condizioni per interferenza distruttiva e costruttiva in funzione della lunghezza d'onda.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=4cm,keepaspectratio=true]{./img/XRD_esp_young.png}
 % XRD_esp_young.png: 318x373 pixel, 96dpi, 8.41x9.87 cm, bb=0 0 238 280
 \caption{Esperimento di Young}
 \label{Fig.:XRD_YOUNG}
\end{figure}


\subsection{Diffrazione di raggi X}
\subsubsection{Breve storia}
I raggi X furono scoperti nel 1895 da Wilhelm R\"{o}ntgen, e 17 anni più tardi Max von Laue
propose che potessero essere diffratti dal passaggio attraverso un cristallo, in quanto
la distanza tra piani nel cristallo è proporzionale alla lunghezza d'onda dei raggi X.
Ciò fu quasi subito confermato e permise lo sviluppo dell'XRD.

L'interpretazione degli spettri di diffrazione ai raggi X per risalire alla struttura delle
molecole, specie se complesse, richiede calcoli matematici estremamente complessi\footnote{La
tesi di dottorato del prof. Gavezotti, esimio cristallografo della nostra Università, era
interamente basata sulla determinazione di una struttura 3D a partire da dati XRD}.
L'avvento dei computer ha modificato profondamente la situazione, semplificando enormemente
il processo di determinazione delle strutture XRD in seguito all'acquisizione dei dati,
tanto che oggi sono note le strutture di oltre 25000 composti organici.

L'applicazione più importante dell'XRD, storicamente, è forse stata permettere l'identificazione
della struttura a doppia elica del DNA.m


\subsubsection{Legge di Bragg}
La prima teoria matematica dell'XRD, che ancora oggi è alla base di tale tecnica, è
la legge di Bragg, del 1913, che esprime la dipendenza della diffrazione di una radiazione elettromagnetica
dalle dimensioni del reticolo cristalino.

Si osservi la figura \ref{Fig.:XRD_Bragg}. $d$ è la distanza tra i piani del cristallo,
ovvero lo spessore della cella cristallina lungo la faccia considerata.
Un fascio di raggi X (blu) incidono la faccia del cristallo con angolo $\alpha$.
Poiché la distanza dalla sorgente è molto grande in rapporto alla lunghezza d'onda
si possono considerare senza perdite in precisione i fronti d'onda come perpendicolari
alla direzione di propagazione, e non archi di una circonferenza avente centro nella sorgente.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/XRD_Bragg.png}
 % XRD_Bragg.png: 880x492 pixel, 96dpi, 23.28x13.02 cm, bb=0 0 660 369
	\caption{Rappresentazione della legge di Bragg.
	I punti neri costituiscono gli atomi della cella cristallina di spessore $d$.
	L'angolo d'incidenza con la faccia del cristallo è $\alpha$.
	$2\sigma$, la porzione in nero, è la distanza di cammino tra i due raggi,
	che deve essere pari a $n\lambda$ per avere interferenza costruttiva.
	$\sigma$ è pari a $d \cdotp \sin \theta$ per trigonometria.}
 \label{Fig.:XRD_Bragg}
\end{figure}

Ne segue che quando il raggio superiore incontra la molecola il raggio inferiore è nel
punto in cui cambia colore da blu a nero.
Il raggio inferiore dovrà poi compiere un tragitto maggiore di $2\sigma$ prima di
raggiungere nuovamente il primo raggio.
A questo punto tra i due si verifica interferenza che può essere costruttiva o distruttiva,
a seconda del rapporto  $2 \sigma / n \lambda$.

Poiché $\sigma$  il complementare di $\alpha$, al variare dell'angolo di incidenza
si può osservare o meno luce diffratta.
Dagli angoli a cui si verifica interferenza costruttiva si può ricavare $d$, essendo note
$\lambda$ ed $\alpha$ quindi $\theta$.

Pertanto:
\begin{align}
	\sigma &= d \cdotp \sin \theta \qquad &\text{(perchè triangolo rettangolo)} \nonumber \\
	n \cdot \lambda &= 2 \cdotp \sigma \qquad &\text{(condizione per interferenza costruttiva)} \nonumber \\
	n \cdot \lambda &= 2 (d \cdotp \sin \theta) &\nonumber \\
	2d &= \frac{n \cdot \lambda}{\sin \theta} &\nonumber \\
	d &= \frac{n \cdot \lambda}{2 \cdotp \sin \theta} & \label{Eq: Bragg}
\end{align}
dove (\ref{Eq: Bragg}) è la legge di Bragg.
Le relazioni con $n = 2,3 \dots$ sono dette di secondo-ordine, terzo-ordine e così via.
Abitualmente si integra $n=1$ in d ottenendo un'espressione alternativa della legge di Bragg:
\begin{align}
	\lambda &= 2 \cdotp \sin \theta \label{Eq: Bragg2}
\end{align}

\subsection{Tecniche XRD}
\subsubsection{XRD cristallo singolo}
Per determinare la struttura di un singolo cristallo di sostanza si esegue l'XRD a
cristallo singolo nella quale una sorgente di raggi X monocromatica è mantenuta fissa
mentre il cristallo ruota su 4 diversi assi, finché non si verifichi riflessione.
Il tutto è controllato da un PC che analizza gli angoli ai quali si verifica
l'interferenza in fase per decidere come ruotare ulteriormente il cristallo ed elabora
nel più breve tempo possibile la struttura dettagliata a livello atomico.
Questo metodo è quello sviluppato da Bragg (William ed il figlio Lawrence, i quali
per questo vinsero il premio Nobel).

\subsubsection{XRD di polveri}
\label{XRPD}
La powder XRD (o XRPD -- \textit{X-Ray Powder Diffraction}) si basa sullo stesso
principio dell'XRD a cristallo singolo ma procedimento e dati ottenibili sono diversi.

C'è sempre una sorgente monocromatica di raggi X ma poi si sfrutta il fatto che tra
tante particelle di polvere ce ne sarà sempre almeno una che dia riflessione ad ogni angolo,
pertanto si ottengono informazioni sol su dimensioni purezza e tipo di cella elementare
del cristallo, ma non sulle distanze interatomiche,
L'identificazione di composti ignoti dal loro spettro XRD-poweder è possibile dal confronto
con i pattern di diffrazione conservati in un'ampia banca dati.

\subsubsection{Applicazioni farmaceutiche dell'XRPD}
\paragraph*{Polimorfi} Dal punto di vista tecnico-farmaceutico la XRD
di polveri è particolarmente importante in quanto ogni forma cristallina è caratterizzata
da un diverso pattern di rifrazione, e pertanto è possibile distinguere i polimorfi.


\paragraph*{Identificazione di API in formulazioni}
L'XRPD permette anche di identificare e/o controllare la presenza di principio attivo
in una forma farmaceutica confrontando gli spettri dell'API puro con quelli della
forma farmaceutica. Ad es. in figura \ref{Fig.:XRPD_api}.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/XRD_powder_API.png}
 % XRD_powder_API.png: 579x380 pixel, 96dpi, 15.32x10.05 cm, bb=0 0 434 285
 \caption{Confronto tra spettri XRPD di API puri (a: paracetamolo, b: acido acetilsalicilico, c: caffeina) con una formulazione in compresse che li contiene.}
 \label{Fig.:XRPD_api}
\end{figure}

\paragraph*{Monitoraggio di transizioni di fase}
L'XRPD può anche essere applicato in ambito produttivo per il controllo delle
transizioni di fase durante il processo di produzione.
Una volta registrati gli spettri delle diverse fasi (es.\ monoidrato, anidro e metastabile)
se ne può valutare la presenza percentuale durante un processo (es.\ essiccamento).

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/XRD_powder_essicca.png}
 % XRD_powder_essicca.png: 914x260 pixel, 96dpi, 24.18x6.88 cm, bb=0 0 685 195
 \caption{Applicazione dell'XRPD al controllo di un processo di essiccamento.}
 \label{Fig.:XRPD_essica}
\end{figure}

\section[Spettroscopia NIR]{Spettroscopia Near Infrared (NIR)}
\subsection{Storia}
La regione dell'infrarosso comprende le radiazioni elettromagnetiche con lunghezza
d'onda compresa tra il visibile ($\lambda \approx 700$\si{\nano \meter}) e le microonde
($\lambda \approx 1$\si{\milli \meter}).

A sua volta la regione dell'IR può essere così scomposta:
\begin{description}
    \item[Vicino IR] compreso tra $780$ e $2500$\si{\nano \meter}, o
	$13000$-$4000$\si{\per \centi \meter} \en{Near IR, NIR};
    \item[Medio IR] compreso tra $2,5$ e $50$\si{\micro \meter}, o
	$4000$-$200$\si{\per \centi \meter} \en{Mid IR, MIR};
    \item[Lontano IR] compreso tra $50$ e $100$\si{\micro \meter}, o
	$200$-$10$\si{\per \centi \meter} \en{Far IR, FIR}.
\end{description}

Anche se nota da tempo la prima applicazione industriale che sfruttasse la regione
del vicino infrarosso (NIR) è solo degli anni Cinquanta, ed accoppiata ad altre tecniche.
Solo a partire dagli anni Ottanta si è sviluppata la spettroscopia NIR come tecnica
autonoma \en{standalone}, ma il vero salto di qualità è avvenuto verso la metà degli
anni '80 con l'adozione della fibra ottica come vettore NIR.

L'adozione della NIR spettroscopy nell'industria farmaceutica è relativamente recente,
e trova impiego nel controllo qualità di materie prime, intermedi ed eccipienti.

\subsection{Teoria}
Essendo situata a numeri d'onda maggiori di $4000$\si{\per \centi \meter} la NIR si
basa su armoniche \en{overtone} molecolari e combinazione di vibrazioni.
Si tratta di fenomeni che danno bande larghe e di difficile attribuzione, ma il principale
problema della NIR è data dalla debolezza del segnale.

Rispetto alla spettroscopia IR classica il confronto degli spettri a scopo di identificazione
è più complesso in quanto necessita di calibrazione con spettri noti.
Sostanze incognite sono identificate con pattern recognition da una banca dati di
spettri noti più che sulla base di attribuzioni teoriche.

\subsubsection{Analisi quantitativa}
L'analisi quantitativa ad un a singola lunghezza d'onda non è possibile, (ma sarebbe
comunque poco precisa) in quanto essendo gli spettri registrati in riflettanza diffusa
più che in trasmittanza non è valida la legge di Lambert-Beer.

E' in ogni caso possibile condurre misurazioni quantitative con elaborazioni software
che si basano sull'analisi multivariata con tecniche di regressione lineare multipla
a partire da una serie di campioni per calibrare lo strumento.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/NIR_quantitativa_acqua.png}
 % NIR_quantitativa_acqua.png: 417x323 pixel, 96dpi, 11.03x8.54 cm, bb=0 0 313 242
 \caption{Determinazione dell'acqua grazie alla banda a 1950 \si{\nano \meter}}
 \label{Fig.:NIR_ACQUA}
\end{figure}


In figura \ref{Fig.:NIR_ACQUA} è mostrata una misurazione quantitativa del contenuto
di acqua mediante NIR, tecnica ampiamente utilizzata per questa applicazione nell'industria
alimentare.

\subsection{Vantaggi}
La NIR penetra il campione più in profondità di un IR classico e, anche se non particolarmente
sensibile permette di sondare materiale sfuso senza preparazione del campione (semplicemente
introducendo la sonda NIR).
Inoltre le analisi possono essere condotte anche da personale non qualificato.

Anche se poco sensibile la NIR è però altamente specifica: non è in grado come l'HPLC
di identificare sostanze presenti in quantità minime ma consente di distingue e enantiomeri
ed isomeri.

\subsection{Strumentazione e misure}
Come sorgente si utilizzando dei diodi emettitori ad infrarossi, più economici rispetto
ad una sorgente ad ampio spettro seguita da un monocromatore.
Nel telerilevamento possono anche essere impiegate fibre ottiche.

In particolare le principali tecniche di misurazione di spettri NIR sono:
\begin{itemize}
	\item trasmissione;
	\item riflettanza totale attenuata (ATR);
	\item riflettanza seculare;
	\item riflettanza diffusa (DRIFT).
\end{itemize}

\subsubsection[Trasmittanza]{Misurazioni in trasmittanza}
Il prerequisito indispensabile per poter procedere alla misurazione di spettri NIR
in trasmittanza è che il campione sia omogeneo, e non vi siano variazioni di
concentrazione o composizione che potrebbero alterare il risultato.

Per sostanze chimiche caratterizzate da un forte assorbimento nella regione del NIR,
poi, è necessario prepararle in spessori molto sottili (qualche \si{\milli \meter}),
oppure devono essere diluiti.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=7cm,keepaspectratio=true]{./img/NIR_trasmittanza.png}
 % NIR_trasmittanza.png: 672x464 pixel, 96dpi, 17.78x12.28 cm, bb=0 0 504 348
 \caption{Procedura per la misurazione di spettri NIR in trasmittanza. (SRC= source, DTC = detector).}
 \label{Fig.:NIR_trasmittanza}
\end{figure}

Il campione è deposto su di una finestra con apposito supporto, chimicamente inerte
al campione (es.\ \ce{KBr}, \ce{NaCl}).
Il cammino ottico è quindi minimo ($\approx 10 \si{\micro \meter}$).

Per informazioni sulla preparazione di pastiglie di \ce{KBr} cfr.\ il corso di
Metodi fisici in chimica organica.

\subsubsection[Riflettanza totale attenuata]{Misurazioni di riflettanza totale attenuata -- (ATR)}
La base teorica delle misurazioni in riflettanza totale attenuata è la cosiddetta
legge di Snell (\ref{Eq: Snell})
[cfr. la sezione \ref{Rifrattometria} ``Rifrattometria'' a pag. \pageref{Rifrattometria}]:
\begin{align}
	n_1 \cdotp \sin \Theta &= n_2 \sin \Phi \label{Eq: Snell}
\end{align}
per la quale quando un'onda elettromagnetica passa da un mezzo con indice di rifrazione
pari ad $n_1$ ad uno con indice di rifrazione minore ($n_2$) si ha una deviazione
del raggio secondo l'equazione (\ref{Eq: Snell}) dove $\Theta$ e $\Phi$ sono gli
angoli tra il raggio di luce e la normale, ovvero la perpendicolare all'interfaccia.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=7cm,keepaspectratio=true]{./img/NIR_ATR_riflessione_totale.png}
 % NIR_ATR_riflessione_totale.png: 514x309 pixel, 96dpi, 13.60x8.17 cm, bb=0 0 385 232
 \caption{Riflessione totale per angoli incidenti maggiori dell'angolo limite (raggio c).}
 \label{Fig.:NIR_ATR_Snell}
\end{figure}

Ne segue che, posto $n_1 > n_2$, esiste un angolo $\Theta$, detto angolo limite ($\Theta_G$) per il quale
$\Phi$ è pari a $90\degree$ ovvero il raggio rifratto è parallelo all'interfaccia e non
propaga più nel secondo mezzo.
Il valore di tale angolo può essere ricavando ponendo
\begin{align}
	\Phi &= 90\degree \nonumber
\end{align}
..da cui..
\begin{align}
	\sin \Phi &= 1 \nonumber \\
	\sin \Theta_G &= \frac{n_2}{n_1}
\end{align}
Per angoli maggiori di $\Theta_G$, quindi, si avrà riflessione totale.

Per le misurazioni ATR, quindi, si pone il campione su di un prisma ad alto indice
di rifrazione (il cristallo ATR, o elemento di riflessione interna) ed angolo superiore
all'angolo limite per far sì che si abbia riflessione totale.

La riflessione totale si ha in seguito all'interazione del raggio con il campione,
ovvero parte della radiazione NIR sarà assorbita dal campione secondo le sue caratteristiche,
quindi il raggio sarà riflesso.
Si forma così un'onda ``evanescente'' cosiddetta in quanto privata di alcune componenti,
che sono quelle assorbite dal campione.
In questo caso, infatti, non si tratta di riflessione semplice ma di riflessione totale
in seguito alla legge di Snell, ovvero la riflessione dipende dalle caratteristiche del
campione (come risulta evidente dal fatto che per un campione con $n$ diverso potrebbe
non verificarsi..).

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/NIR_ATR_enhanced.png}
 % NIR_ATR_enhanced.png: 419x187 pixel, 96dpi, 11.08x4.95 cm, bb=0 0 314 140
 \caption{Amplificazione ($4$X) del segnale ATR.}
 \label{Fig.:NIR_ATR_surface_enhanced}
\end{figure}


Il problema è che la quantità di radiazione adsorbita dall'interfaccia è minima in quanto
il percorso del raggio nel campione è minimo. Il signal-to-noise ratio, però, può essere
incrementato moltiplicando questo effetto più volte in serie attraverso un cristallo
di forma adeguata, come illustrato in figura \ref{Fig.:NIR_ATR_surface_enhanced}.

\paragraph*{Vantaggi}
La tecnica ATR è molto utilizzata per i liquidi, ma non solo, ed i suoi vantaggi
sono dati dal fatto che non necessità di preparazione del campione, è ideale per
prodotti altamente assorbenti ed è conservativa.

\subsection[Riflettanza diffusa]{Misurazioni di riflettanza diffusa -- (DRIFT)}
Se le misurazioni NIR ATR sono particolarmente adatte ai liquidi, le misurazioni
DRIFT lo sono per i solidi.

Tecnicamente si misura la componente diffusa della radiazione IR e si misura la
componente adsorbita. In questo caso la parte di radiazione direttamente riflessa è ``persa'', e
pertanto può essere utile preparare il campione con pastiglie di \ce{KBr} il
cui effetto è diminuire appunto l'entità della riflessione diretta.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=5cm,keepaspectratio=true]{./img/NIR_DRIFT_schema.png}
 % NIR_DRIFT_schema.png: 445x478 pixel, 96dpi, 11.77x12.65 cm, bb=0 0 334 358
 \caption{Schema della componente di riflessione diffusa sfruttata dalla DRIFT.}
 \label{Fig.:NIR_DRIFT_schema}
\end{figure}

Trascurando la componente riflessa dalla superficie del campione (studiata da
Fresnel) e concentrandosi sulla componente di riflettanza diffusa non si può derivare
una relazione deterministica tra intensità delle bande e concentrazione dei componenti.
Semplificando la trattazione a campioni diluiti in matrici non assorbenti si può
ricavare la legge di Kubelka-Munk, per cui:
\begin{align}
	f(R_\infty) &= (1-R_\infty) 2/2R_{\infty} = 2,303 \alpha C/s \label{Eq.: Kubelka-Munk}
\end{align}
dove $R_\infty$ è la riflettanza diffusa da un campione di spessore infinito,
$\alpha$ il coefficiente di assorbimento, $C$ la concentrazione ed $s$ un coefficiente di
diffusione.
Per calcoli quantitativi, quindi, l'unità in ascissa non sarà più l'assorbanza
ma ``l'unità Kubela-Munk'' (KM) che varia linearmente con la concentrazione di campione.

La riflettanza diffusa è ideale per campioni solidi, e la diluizione con matrici non
assorbenti quali \ce{KBr} permette di ottenere spettri più ``puliti'', privi delle
interferenze riflessive e quindi con una maggior componente diffusiva.

Le misure di riflettanza diffusa possono essere effettuate anche mediante fibre ottiche,
dove il decadimento del segna in funzione della distanza è trascurabile fino a $50$\si{\meter}
e minimo anche per lunghezze superiori (cfr.\ grafico ).
A causa della scarsa quantità di energia riflessa dai campioni solitamente non si utilizza una
configurazione a singola fibra ma vengono utilizzati ``fiber bundle''.

\subsection{Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM)}
\esame[2/5/11]{Illustrare brevemente la spettroscopia NIR e le applicazioni nella farmaceutica.}
La tecnica ``Focused Beam Reflectance Measurement'' (FBRM), attualmente sotto brevetto,
si basa sulla retro-diffusione della luce da parte di particelle.
Un sistema ottico rotante fa sì che la sorgente laser descriva delle circonferenze
di raggio prefissato e con messa a fuoco ad una distanza $d$ dall'ottica.
Quando alla distanza d in cui la luce laser è focalizzata è presente una particella
si ha diffusione e parte della luce torna indietro verso la sorgente dove viene
registrata da un detector.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=5cm,keepaspectratio=true]{./img/FBRM_threshold.png}
 % FBRM_threshold.png: 267x286 pixel, 96dpi, 7.06x7.57 cm, bb=0 0 200 214
 \caption{Determinazione delle dimensioni particellari e relazione con il superamento della soglia di luce diffusa in funzione del tempo.}
 \label{Fig.:FBRM_soglia}
\end{figure}


Se la luce registrata supera un valore soglia si ritiene che sia presente una particella
mentre quando, nel movimento del laser, la particella ``finisce'' si avrà un interruzione
nella luce riflessa (vedi figura \ref{Fig.:FBRM_soglia}).
Ogni particella è quindi caratterizzata da un intervallo di tempo continuato nel quale
si verifica la diffusione.
il prodotto dalla velocità tangenziale connessa alla rotazione del laser per il tempo
continuativo di ogni particella da' informazioni sulle sue dimensioni (in particolare
è misurata la distanza della corda).

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=5cm,keepaspectratio=true]{./img/FBRM_schema.png}
 % FBRM_schema.png: 270x237 pixel, 96dpi, 7.14x6.27 cm, bb=0 0 202 178
 \caption{Schema di una sonda FBRM}
 \label{Fig.:FBRM_schema}
\end{figure}


Questo apparato è posto al vertice di una sonda (vedi schema in figura \ref{Fig.:FBRM_schema})
alla quale proviene una fibra ottica per il raggio laser e da cui diparte un'altra fibra
che va al detector.
Si ottengono così informazioni accurate ed in continuo sulla granulometria di un
campione.
I dati ottenuti sono d'importanza cruciale nel processo di macinazione, nella quale, non a
caso, l'FBRM è oggi spesso integrata nella determinazione dell'avanzamento e per
impostarne i parametri di processo critici (il cui controllo è cruciale, come ha ricordato
l'FDA, per il loro impatto sulla qualità).

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/NIR_fibra_ottica.png}
 % NIR_fibra_ottica.png: 432x301 pixel, 96dpi, 11.43x7.96 cm, bb=0 0 324 226
 \caption{Decadimento prestanzionale del NIR su fibra ottica.}
 \label{Fig.:NIR_fibra}
\end{figure}

\subsection[NIR in Ph. Eur.]{Le indicazioni della Ph. Eur. sulla spettroscopia NIR}
Alla spettrometria NIR è dedicata una monografia della Farmacopea Europea.

\begin{PhEur}[NEAR-INFRARED SPECTROPHOTOMETRY]{2.2.40}
Near-infrared (NIR) spectrophotometry is a technique with
wide and varied applications in pharmaceutical analysis. The
NIR spectral range extends from about $780 \nm$ to about
$2500 \nm$ (from about $12 800$\-\si{\per \centi \meter} to about $4000$\si{\per \centi \meter}).
In some cases the most useful information is found in the
spectral range from about $1700 \nm$ to about $2500 \nm$
(from about $6000\si{\per \centi \meter}$ to $4000\si{\per \centi \meter}$).
NIR spectra are
dominated by C-H, N-H, O-H and S-H overtone resonances
and combinations of fundamental vibrational modes; they
have a high informative character if the information is
extracted by suitable chemometric algorithms. NIR bands
are much weaker than the fundamental mid-IR vibrations
from which they originate. Because molar absorptivities in
the NIR range are low, radiation typically penetrates several
millimeters into materials, including solids. Furthermore,
many materials such as glass are relatively transparent in
this region.

Measurements can be made directly on in situ samples,
in addition to standard sampling and testing procedures.
Physical as well as chemical information, both qualitative
and quantitative, is available from NIR spectra. However,
direct comparison of the spectrum obtained with the
substance being examined with a reference spectrum of a
chemical reference substance, as used in infrared absorption
spectrophotometry, is not appropriate. Suitable validated
mathematical treatment of the data is required.

NIR spectrophotometry has a wide variety of applications for
both chemical and physical analysis, for example :
\emph{chemical analysis}
\begin{itemize}
	\item identification of active substances, excipients, dosage
forms, manufacturing intermediates, chemical raw
materials and packaging materials,

	\item quantification of active substances and excipients,
determination of chemical values such as hydroxyl value,
iodine value, acid value, determination of water content,
determination of degree of hydroxylation, control of
solvent content,

	\item process control.
\end{itemize}

\emph{physical analysis}
\begin{itemize}
	\item crystalline form and crystallinity, polymorphism,
pseudopolymorphism, particle size,

	\item dissolution behaviour, disintegration pattern, hardness,

	\item examination of film properties,

	\item process control, for example monitoring of blending and
granulation.
\end{itemize}
Measurements in the NIR region are influenced by
many chemical and physical factors as described below;
reproducibility and relevance of results depend on control
of these factors and measurements are usually valid only for
a defined calibration model.

APPARATUS\\
NIR spectrophotometers are used for recording spectra
in the region of about $780 \nm$ to about $2500 \nm$ (about
$12 800\si{\per \centi \meter}$ to about $4000\si{\per \centi \meter}$). All NIR measurements
are based on passing light through or into a sample and
measuring the attenuation of the emerging (transmitted,
scattered or reflected) beam. Spectrophotometers for
measurement in the NIR region consist of a suitable light
source, a monochromator or interferometer. Common
monochromators are acousto-optical tuneable filters (AOTF),
gratings or prisms. High intensity light sources such as
quartz or tungsten lamps or similar are used. The tungsten
lamp light source can be highly stabilised. Therefore many
NIR instruments have the single-beam design. Silicon, lead
sulphide, indium arsenide, indium gallium arsenide, mercury
cadmium telluride (MCT) and deuterated triglycine sulphate
are commonly used detector materials. Conventional cuvette
sample holders, fibre-optic probes, transmission dip cells and
spinning or traversing sample holders are a few common
sampling devices. The selection is based on the intended
application, paying particular attention to the suitability of
the sampling system for the type of sample to be analysed.
Suitable data processing and evaluation units are usually
part of the system.

MEASUREMENT METHODS\\
\paragraph*{Transmission mode}
Transmittance (T) is a measure of the decrease in radiation intensity at given wavelengths when
radiation is passed through the sample. The sample is placed in the optical beam between the source and detector. The
arrangement is analogous to that in many conventional
spectrophotometers and the result can be presented directly in terms of transmittance ($T$) or/and absorbance ($A$).

\begin{align*}
	T	&= \frac{I}{I_0} &\\
	I_0	&= \text{intensity of incident radiation,} & \\
	I	&= \text{intensity of transmitted radiation,} & \\
	A	&= -\log_{10} T = \log \left( \frac{1}{T} \right) = \log \left( \frac{I_0}{I} \right). &
\end{align*}

\paragraph*{Diffuse reflection mode}
The diffuse reflection mode gives a measure of reflectance ($R$), the ratio of the intensity of
light reflected from the sample ($I$) to that reflected from a
background or reference reflective surface ($I_r$).
NIR radiation can penetrate a substantial distance into the sample, where it can
be absorbed by vibrational combinations and overtone resonances of the analyte species present in the sample.
Non-absorbed radiation is reflected back from the sample to the detector.
NIR reflectance spectra are typically obtained by calculating and plotting log ($1/R$) versus the wavelength or wavenumbers.

\begin{align*}
	R	&= \frac{I}{I_r} &\\
	I	&= \text{intensity of light diffusively reflected from the sample,} & \\
	I_r	&= \text{intensity of light reflected from the background or} & \\
		&  \text{reference reflective surface,} & \\
	A_R	&= -\log_{10} \left( \frac{1}{R} \right) = \log \left( \frac{I_r}{I} \right). &
\end{align*}

\paragraph*{Transflection mode}
This mode is a combination of transmittance and reflectance.
In the measurement of transflectance ($T^*$) a mirror or a diffuse reflectance
surface is used to reflect the radiation transmitted through the
sample a second time and thus doubling the pathlength.
Non-absorbed radiation is reflected back from the sample to
the detector.

\begin{align*}
	T^*	&= \frac{I}{I_T} &\\
	I_T	&= \text{intensity of transflected radiation, without sample,} & \\
	I_r	&= \text{intensity of transmitted and reflected radiation measured with} & \\
		&  \text{the sample,} & \\
	A^*	&= -\log_{10} \left( \frac{1}{T^*} \right). &
\end{align*}


SAMPLE PREPARATION/PRESENTATION\\
\paragraph*{Transmission mode} The measurement of transmittance (T)
is dependent on a background transmittance spectrum
for its calculation. A background reference can be air,
an empty cell, and a solvent blank or in special cases a
reference sample. The method generally applies to liquids,
diluted or undiluted, dispersions, solutions and solids. For
transmittance measurements of solids, a suitable sample
accessory is to be used. The samples are examined in a cell
of suitable pathlength (generally $0.5$-$4 \mm)$, transparent to
NIR radiation, or by immersion of a fibre optic probe of a
suitable configuration, which yields a spectrum situated in a
zone of transmission compatible with the specifications of
the apparatus and appropriate for the intended purpose.

\paragraph*{Diffuse reflection mode} This method generally applies
to solids. The sample is examined in a suitable device.
Care must be taken to make the measuring conditions as
reproducible as possible from one sample to another. When
immersing a fibre optic probe in the sample, care must
be taken in the positioning of the probe to ensure that it
remains stationary during the acquisition of the spectra
and that the measuring conditions are as reproducible as
possible from one sample to another. The reflected radiation
of a background reference is scanned to obtain the baseline,
and then the reflectance of one or more analytical samples
is measured. Common reflectance references are ceramic
tiles, perfluorinated polymers and gold. Other suitable
materials may be used. Only spectra measured against a
background possessing the same optical properties can
 be directly compared with one another. The particle size,
water of hydration and state of solvation must be taken into
consideration.

\paragraph*{Transflection mode} A reflector is placed behind the sample
 so as to double the pathlength. This configuration can
 be adopted to share the same instrument geometry with
reflectance and fibre optic probe systems where the source
 and the detector are on the same side of the sample. The
 sample is examined in a cell with a mirror or a suitable
 diffusive reflector, made either of metal or of an inert
substance (for example titanium dioxide) not absorbing in
the NIR region.


FACTORS AFFECTING SPECTRAL RESPONSE\\
\paragraph*{Sample temperature} This parameter is important for
aqueous solutions and many liquids, where a difference of
a few degrees can result in substantial spectral changes.
Temperature is also an important parameter for solids and
powders containing water.

\paragraph*{Moisture and solvent residues} Moisture and solvent
residues present in the samples will contribute significant
absorption bands in the NIR region.

\paragraph*{Sample thickness} Sample thickness is a known source
 of spectral variability and must be understood and/or
controlled. For example, in a reflection measurement the
sample may be ``infinitely'' thick, or thinner samples of
constant thickness must have a stable, diffusively reflecting
backing material of constant, and preferably high reflectivity.

\paragraph*{Sample optical properties} In solids, both surface and bulk
scattering properties of samples must be taken into accountSpectra of physically, chemically or optically heterogeneous
samples may require sample averaging by increasing the
beam size or examining multiple samples or spinning the
probe. Certain factors such as differing degree of compaction
or particle size in powdered materials and surface finish can
cause significant spectral differences.

\paragraph*{Polymorphism} The variations in crystalline structure
(polymorphism) influence the spectra. Hence different
crystalline forms as well as the amorphous form of a solid
may be distinguished from one another on the basis of
their NIR spectra. Where multiple crystalline forms are
present, care must be taken to ensure that the calibration
standards have a distribution of forms relevant to the
intended application.

\paragraph*{Age of samples} Samples may exhibit changes in their
chemical, physical or optical properties over time. Care
must be taken to ensure that samples for NIR analysis are
representative of those used for calibration. If samples of
different age are to be analysed, potential differences in the
properties must be accounted for.

[...]

IDENTIFICATION AND CHARACTERISATION (QUALITATIVE ANALYSIS)\\
\paragraph*{Establishment of a spectral reference library} Record the
spectra of a suitable number of batches of the substance
which have been fully tested according to established
specifications and which exhibit the variation typical for
the substance to be analysed (for example, manufacturer,
physical form, particle size). The set of spectra represents
the information for identification and characterisation that
defines the similarity border for that substance and is the
entry for that substance in the spectral library used to
identify the substance. The number of substances in the
library depends on the specific application, but libraries that
are too big can cause some difficulties in discriminating
between different materials and in validation. All spectra in
the library used have the same:
\begin{itemize}
 \item spectral range and number of data points,
 \item technique of measurement,
 \item technique of measurement,
 \item data pre-treatment.
\end{itemize}

If sub-groups (libraries) are created, the above criteria
are applied independently for each group. The collection
of spectra in the library may be represented in different
ways defined by the mathematical technique used for
identification. These may be:
\begin{itemize}
 \item all individual spectra representing the substance,
 \item a mean spectrum of each batch of substance,
 \item if necessary, a description of the variability within the
substance spectra. 
\end{itemize}
Electronic raw data for the preparation of the spectral library must be archived.

\paragraph*{Pre-treatment of data} In many cases, and particularly
for reflection mode spectra, some form of mathematical
pretreatment of the spectrum may be useful before the
development of a classification or calibration model. The
aim can be, for example, to reduce baseline variations, to
reduce the impact of known variations that are interfering
in the subsequent mathematical models, or to compress
data before use. Typical methods are multiplicative scatter
correction (MSC), the Kubelka-Munk transforms, spectral
compression techniques that may include windowing and
noise reduction and the numerical calculation of the first-
or second-order derivative of the spectrum. Higher-order
derivatives are not recommended. In some cases spectra
may also be normalised, for example against the maximum
absorbance, the mean absorbance or the integrated
absorbance area under the spectrum.

Caution must be excercised when performing any
mathematical transformation, as artefacts can be introduced or essential information (important with qualification
methods) can be lost. An understanding of the algorithm
is required and in all cases the rationale for the use of
transform must be documented.

\paragraph*{Data evaluation} Direct comparison of the spectrum of the
substance under investigation is made with the individual
or mean reference spectra of all substances in the database on the basis of their mathematical correlation or other
suitable algorithms. A set of known reference mean spectra and the variability around this mean can be used with an
algorithm for classification. There are different algorithms
based on principal component analysis (PCA) combined
with cluster analysis, SIMCA (soft independent modelling by class analogy), COMPARE functions using filters or UNEQ
(unequal dispersed class) and others used in the software of NIR instruments or supplied as third-party software. The
reliability of the algorithm chosen for a particular application has to be validated. For example, correlation coefficient,
the sum of squared residuals or the distance using cluster
analysis must comply with the acceptance limits defined in
the validation procedure.

\paragraph*{Validation of the database}
\emph{Specificity} The selectivity of the classification using
database spectra for positive identification of a given
material and adequate discrimination against other materials in the database is to be established during the validation
procedure. Acceptance thresholds are established. High
thresholds achieve a higher discriminatory power, but may
cause some errors due to the own variability of materials.
Lower thresholds solve these problems, but could produce
ambiguous results. Potential challenges must be addressed
to the spectral database. These can be materials received
on site that are similar to database members in visual
appearance, chemical structure or by name. This challenge
must fail identification. Independent samples of materials
represented in the database, but not used to create it (i.e.
different batches, blends) must give positive identification
when analysed.

\emph{Robustness} The robustness of the qualitative procedure
must also be challenged to test the effect of minor changes
to normal operating conditions on the analysis. There must
be no changes to pre-processing and calibration algorithm
parameters. Typical challenges are:
\begin{itemize}
    \item effect of differences across operators on variations in
environmental conditions (for example, temperature and
humidity in the laboratory),
    \item effect of sample temperature, sample positioning on the
optical window and probe depth and compression/packing
of material,
    \item replacement of instrument parts or sampling presentation
devices.
\end{itemize}

QUANTITATIVE ANALYSIS\\
\paragraph*{Establishment of a spectral reference library for a
calibration model} Calibration is the process of constructing
a mathematical model to relate the response from an
analytical instrument to the properties of the samples. Any
calibration algorithm that can be clearly defined in an exact
mathematical expression and gives suitable results can be
used. Record spectra of a suitable number of samples with
known values of the content throughout the range to be
measured (for example, content of water). Wavelengths used
in the calibration model can be compared to the known
bands of the analyte and those of the matrix to verify that
the bands of the analyte of interest are being used by the
calibration. Establish the calibration model with about
two-thirds of the measured samples. Compare the remaining
one-third of the measured samples with the database. All
samples must give quantitative results within a precision
interval as defined by the intended purpose of the method.
Correct quantification must be demonstrated in the presence
of variations in the matrix within the specified range.
Multiple linear regression (MLR), partial least squares (PLS)
and principal component regression (PCR) are commonly
used. For PLS or PCR calibrations, the coefficients or the
loadings can be plotted and the regions of large coefficients
compared with the spectrum of the analyte. Raw data for
the preparation of the calibration model must be archived,
without data pretreatment.

\paragraph*{Pre-treatment of data} Data pre-treatment can be defined
as the mathematical transformation of the NIR spectral
data to enhance spectral features and/or remove or reduce
unwanted sources of variation prior to the development of
the calibration model. Many suitable algorithms for data
pre-treatment and calibration exist. The selection is based on
the suitability for the intended use. Wavelength selection
may enhance the efficiency of calibration models such as
MLR (for example, in particle-size determination). It is useful
to delete certain ranges of the wavelength scale in some
cases, for example in the determination of water of hydration.
Wavelength compression may be applied to the data.

\paragraph*{Validation parameters} Analytical performance
characteristics to be considered for demonstrating the
validation of NIR methods are similar to those required
for any analytical procedure. Specific acceptance criteria
for each validation parameter must be consistent with the
intended use of the method.

\emph{Specificity} The relative discriminatory power and selectivity
for quantitative determination must be similar to those
mentioned under Qualitative analysis. The extent of
specificity testing is dependent on the application and the
risks being controlled. Variations in matrix concentrations
within the operating range of the method must not affect the quantitative measurement significantly.

\emph{Linearity} The validation of linearity involves the correlation
of NIR results calculated from NIR responses within the
used algorithms to reference method results distributed
throughout the defined range of the calibration model.
Actual NIR responses that are non-linear may still be valid.
Range. The range of analyte reference values defines the
range of the NIR method and quantitation limits of the
method. Controls must be in place to ensure that results
outside the validated range are not accepted.

\emph{Accuracy} This can be determined by comparison with
the validation method or with known samples (samples of
blank and added amounts of tested substance). Accuracy
can be indicated by the standard error of prediction (SEP)
of the NIR method that should be in close agreement with
the data of the validated method. The SEP is the standard
deviation of the residuals obtained from comparing the
NIR results with analytical reference data for the specified
samples. It is demonstrated by correlation of NIR results
with analytical reference data, by comparison of the SEP
to the reference method used for validation. Alternatively
statistical comparison methods may be used to compare NIR results with reference values (paired t-test, bias evaluation).

\emph{Precision} This expresses the closeness of agreement
between a series of measurements under the prescribed
conditions. It is assessed by a minimum of 6 measurements
performed according to the developed analytical method.
Precision may be considered at 2 levels, repeatability
(replicate measurements of the same sample with or without
variation in sample positioning) and intermediate precision
(replicate measurements by different analysts, different days of measurements).

\emph{Robustness} This includes the effects of variations of
temperature, humidity, sample handling and the influence
of instrument changes.
for any analytical procedure. Specific acceptance criteria
for each validation parameter must be consistent with the
intended use of the method.

\emph{Outliers} Outlier results from NIR measurements of a sample containing an analyte outside the calibration range indicates
that further testing is required. If further testing of the
sample by an appropriate analytical method gives the analyte content within the specifications, this may be accepted and
considered to have met the specifications. Thus an outlier
result generated by NIR measurements of the sample may
still meet specifications for the analyte of interest.
\end{PhEur}


%PARTE NON IMPORTANTE
\begin{comment}
\subsubsection{Trasmittanza}
\begin{PhEur}[PREPARATION OF THE SAMPLE FOR RECORDING BY TRANSMISSION OR ABSORPTION]{2.2.24}
Prepare the substance by one of the following methods.

\paragraph*{Liquids}
Examine a liquid either in the form of a film between
2 plates transparent to infrared radiation, or in a cell of
specified. Grind the mixture, place it in a sample cup and
suitable path length, also transparent to infrared radiation.
examine the reflectance spectrum.

\paragraph*{Liquids or solids in solution}
Prepare a solution in a suitable
solvent. Choose a concentration and a path length of the
cell which give a satisfactory spectrum. Generally, good
results are obtained with concentrations of 10-100 g/l for a
path length of 0.5-0.1 mm. Absorption due to the solvent
is compensated by placing in the reference beam a similar
cell containing the solvent used. If an FT-IR instrument
is used, the absorption is compensated by recording the
spectra for the solvent and the sample successively. The
solvent absorbance, corrected by a compensation factor, is
subtracted using calculation software.

\paragraph*{Solids}
Examine solids dispersed in a suitable liquid (mull)
or in a solid (halide disc), as appropriate. If prescribed in
monograph, make a film of a molten mass between 2 plates
transparent to infrared radiation.

\begin{itemize}
	\item[A] Mull\\
Triturate a small quantity of the substance to be examined
with the minimum quantity of liquid paraffin R or other
suitable liquid ; 5-10 mg of the substance to be examined
is usually sufficient to make an adequate mull using one
drop of liquid paraffin R. Compress the mull between
2 plates transparent to infrared radiation.

	\item[B] Disc\\
Triturate 1-2 mg of the substance to be examined
with $300$-$400$ \si{\milli \gram}, unless otherwise specified, of finely
powdered and dried \emph{potassium bromide R} or \emph{potassium
chloride R}. These quantities are usually sufficient to
give a disc of $10$-$15$ \si{\milli \meter} diameter and a spectrum of
suitable intensity. If the substance is a hydrochloride, it
is recommended to use \emph{potassium chloride R}. Carefully
grind the mixture, spread it uniformly in a suitable
die, and submit it to a pressure of about $800$ MPa
($8$ \si{t \per \centi \meter \squared}).
For substances that are unstable under normal
atmospheric conditions or are hygroscopic, the disc is
pressed \emph{in vacuo}. Several factors may cause the formation
of faulty discs, such as insufficient or excessive grinding,
humidity or other impurities in the dispersion medium or
an insufficient reduction of particle size. A disc is rejected
if visual examination shows lack of uniform transparency
or when transmittance at about $2000$ \si{\per \centi \meter} ($5$ \si{\micro \meter}) in the
absence of a specific absorption band is less than $60$ per
cent without compensation, unless otherwise prescribed.
\end{itemize}

\paragraph*{Gases} Examine gases in a cell transparent to infrared
radiation and having an optical path length of about $100$ \si{\mm}.
Evacuate the cell and fill to the desired pressure through a
stopcock or needle valve using a suitable gas transfer line
between the cell and the container of the gas to be examined. 
manufacturer. The resolution is checked by suitable means,

If necessary adjust the pressure in the cell to atmospheric
pressure using a gas transparent to infrared radiation (for
example \emph{nitrogen R} and \emph{argon R}). To avoid absorption
interferences due to water, carbon dioxide or other
atmospheric gases, place in the reference beam, if possible,
an identical cell that is either evacuated or filled with the gas
transparent to infrared radiation.
\end{PhEur}
 
\subsubsection{Riflettanza diffusa}
\begin{PhEur}[PREPARATION OF THE SAMPLE FOR RECORDING BY DIFFUSE REFLECTANCE]{2.2.24}
\ %That's an horrible hack to overdue an unexplanable latex limitation: can't begin with \paragraph -.-''
\paragraph*{Solids} Triturate a mixture of the substance to be examined
with finely powdered and dried \emph{potassium bromide R}
or \emph{potassium chloride R}. Use a mixture containing
approximately $ 5 $ per cent of the substance, unless otherwise
specified.
Grind the mixture, place it in a sample cup and
examine the reflectance spectrum.

The spectrum of the sample in absorbance mode may be
obtained after mathematical treatment of the spectra by the
Kubelka-Munk function.
\end{PhEur}

\subsubsection{ATR}
\begin{PhEur}[PREPARATION OF THE SAMPLE FOR RECORDING BY ATTENUATED TOTAL REFLECTION]{2.2.24}
Attenuated total reflection (including multiple reflection)
involves light being reflected internally by a transmitting
medium, typically for a number of reflections. However,
several accessories exist where only one reflection occurs.

Prepare the substance as follows. Place the substance to be
examined in close contact with an internal reflection element
(IRE) such as diamond, germanium, zinc selenide, thallium
bromide-thallium iodide (KRS-5) or another suitable material
of high refractive index. Ensure close and uniform contact
between the substance and the whole crystal surface of the
internal reflection element, either by applying pressure or
by dissolving the substance in an appropriate solvent, then
covering the IRE with the obtained solution and evaporating
to dryness. Examine the attenuated total reflectance (ATR)
spectrum.
\end{PhEur}
\end{comment}


\addcontentsline{toc}{part}{Tecniche spettroscopiche}
\chapter{NMR}
La risonanza magnetica nucleare \en{Nuclear Magnetic Resonance, NMR} è una tecnica spettroscopica
largamente utilizzata in ambito chimico che si basa sull'assorbimento per risonanza di radiazioni
nel campo delle radiofrequenze da parte di nuclei di atomi cosiddetti ``magnetici''.

\section{Teoria generale}
\subsection{Spin atomico}
\subsubsection{Numero di spin}
Sono detti magnetici, e sono visibili all'NMR, quegli atomi il cui numero di spin sia diverso
da zero.

Il numero di spin di un atomo dipende dal bilancio tra i numeri di spin delle particelle subatomiche
che lo compongono.
In generale per avere spin diverso da zero un atomo deve avere un numero di protoni o
neutroni dispari (spin frazionario, es.\ $1/2$, $3/2$, $5/2$\dots) oppure sia protoni sia
neutroni dispari (spin intero, es.\ 1, 2, 3\dots).

\begin{table}
\centering

\begin{tabular}{cccc}
\textbf{Protoni} & \textbf{Elettroni} & \textbf{Spin} & \textbf{Esempi} \\ \hline \T
pari	& pari	& 0	&	\ce{^{12}C}, \ce{^{16}O}, \ce{^{32}S}\\
dispari	& pari	& $1/2$	&	\ce{^{1}H}, \ce{^{19}F}, \ce{^{31}P}\\
dispari	& pari	& $3/2$	&	\ce{^{11}B}, \ce{^{35}Cl}, \ce{^{79}Br}\\
pari	& dispari& $1/2$&	\ce{^{13}C}\\
pari	& dispari& $3/2$&	\ce{^{127}I}\\
pari	& dispari& $5/2$&	\ce{^{17}O}\\
dispari	& dispari& $1$	&	\ce{^{2}H}, \ce{^{14}N}\\
\end{tabular}

\caption{Esempi di alcuni atomi con i rispettivi numeri di spin.}
\end{table}

\subsubsection{Effetto del campo magnetico}
Per un atomo magnetico si avranno due popolazioni di atomi, l'una con segno di spin positivo ($\alpha$)
e l'altra con segno negativo ($\beta$).
In assenza di campi magnetici esterni i due livelli energetici (spin alpha e spin beta) sono degeneri,
ovvero entrambi hanno la stessa energia.

Applicando un campo magnetico esterno la degenerazione viene meno e lo stato $m_S = + \frac{1}{2}$
incrementa la propria energia rispetto al valore degenere precedente, mentre $m_S = - \frac{1}{2}$ la diminuisce.
La differenza di energia tra le due popolazioni di spin è pari a
$\varDelta E = E_{\alpha} - E_{\beta} = {\mu} B_0$.

Dove  $E_{\alpha}$ ed $E_{\beta}$ sono i livelli energetici corrispondenti alle due popolazioni di spin.
$B_0$ è il campo magnetico applicato e $\mu$ è il momento
magnetico nucleare, il quale dipende dal nucleo considerato.

In breve, pertanto, la differenza tra i livelli energetici dipende dal campo magnetico applicato
e dal tipo di atomo considerato.

\subsubsection{Rappresentazione grafica}
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=5cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_precessione_nucleo.png}
 % NMR_precessione_nucleo.png: 304x268 pixel, 96dpi, 8.04x7.09 cm, bb=0 0 228 201
 \caption{Rappresentazione del moto di precessione di un nucleo in un campo magnetico $B_0$}
 \label{Fig.:NMR_nucleo_precessione}
\end{figure}
L'effetto del campo magnetico sul nucleo può essere rappresentato come il moto di
precessione del momento di dipolo magnetico del nucleo (che può essere interpretato
come il prodotto dalla rotazione degli elettroni attorno all'atomo) attorno all'asse
rappresentato dal campo magnetico esterno.
Poiché per il principio di Heisenberg non è possibile conoscere le componenti x ed y
del momento angolare una descrizione più precisa sarebbe data da un cono ruotante
alla frequenza di Larmor frequenza $\nu_L$\footnote{Si può dimostrare che la ``lunghezza''
del vettore di magnetizzazione nucleare $\mu$ è data da $\sqrt{I(I+1)}$ dove I è il
numero quantico di spin dell'atomo ($\sqrt{3}/2$ per il protone).
Per questo atomi con spin nullo non possono essere studiati mediante NMR.
La proiezione lungo z, invece, è data da $I$, che e per il protone è $-\frac{1}{2}$.
I più attenti avranno capito che l'angolo tra il cono e l'asse z è, per il protone,
di circa $55\degree$, dato dall'arcocoseno del rapporto tra spin e ``lunghezza'' del
momento di dipolo. Ovvero $\arccos (1/\sqrt{3})$}.

\subsection{Risonanza}
Ricordando che l'energia associata ad una radiazione elettromagnetica è $E = h \cdotp \nu$, se si
irradia una sostanza contenente atomi magnetici immersa in un campo magnetico $B_0$
con una radiazione frequenza $\nu$ tale che:
\begin{displaymath}
	h \cdotp \nu = {\mu} B_0 = \varDelta E \; (E_{\alpha} - E_{\beta})
\end{displaymath}
si ha che l'energia fornita dalla radiazione, per risonanza, eccita gli atomi del livello
energetico inferiore e li promuove al superiore.
Successivamente, in seguito all'interruzione dell'irraggiamento, i nuclei eccitati torneranno
al livello energetico precedente secondo il FID (free induction decay) emettendo una
radiazione analoga a quella con cui sono stati eccitati, ovvero nel campo delle radiofrequenze.
E' questa radiazione riemessa che costituisce il segnale negli esperimenti NMR moderni.

\subsection{Intensità del segnale}
L'intensità del segnale NMR dipende da quanta energia è assorbita (e quindi riemessa)
nell'intervallo di tempo.
Quest'ultima è data da quanti fotoni sono assorbiti nell'unità di tempo per l'energia di
ciascun fotone.

L'energia di un fotone assorbito è pari ad $h\nu$ dove $\nu$ è la frequenza di Larmor
che dipende dal campo magnetico a meno di una costante ($\nu = \gamma / (2\pi) \cdotp B_0$).

La quantità di fotoni assorbita dipende dal numero di fotoni nello stato di energia più
basso($N_\alpha$), meno quelli allo stato eccitato\footnote{Così facendo trascuriamo l'autoemissione
da parte dello stato eccitato, che è, appunto, trascurabile alle basse frequenze dell'NMR.}
($N_\beta$)\footnote{Se ti stai chiedendo come mai ora $\alpha$ indichi lo stato meno
energetico è perché si sta considerando il caso dell'NMR-$1^H$ avente spin$= -\frac{1}{2}$
pertanto, a causa del segno meno, le popolazioni si ``invertono''.}.
\begin{align}
	Segnale &\propto (N_\alpha - N_\beta) \cdotp B_0 \label{Eq.: Segnale NMR}
\end{align}

La differenza tra le due popolazioni di spin, in accordo con l'equazione di Arrenhius, è pari a:
\begin{align}
	\frac{N_\beta}{N_\alpha} &= e^{-\varDelta E / kT}
\end{align}

Dove $\varDelta E $ è $E_\beta - E_\alpha$, generalmente piccolo rispetto a $kT$, pertanto
si può approssimare il fattore esponenziale a $1-\frac{\varDelta E}{kT}$\footnote{Lo
sviluppo di Taylor per $e^x$, infatti, sarebbe $1 + x + \frac{1}{2}x^2 \dots$.
Per $e^x$ con $x$ piccolo è valida l'approssimazione $e^x \approx (1 - x)$.}:
\begin{align*}
	\frac{N_\beta}{N_\alpha} &\approx 1 - \frac{\varDelta E}{kT} = 1 - \frac{\gamma \cdotp B_0}{kT} 
\end{align*}
da cui, con passaggi matematici e approssimazioni, integrando in k' tutte le costanti:
\begin{align}
	N_\alpha - N_\beta &\approx k' \cdotp \frac{\gamma \cdotp N \cdotp B_0}{T} \label{Eq.: DeltaSpinNMR}
\end{align}
dove $\gamma$ è la costante giromagnetica dell'atomo considerato, $N$ il numero di molecole
dotate di spin, $T$ la temperatura e $B_0$ il campo magnetico applicato.

Considerando quindi l'equazione (\ref{Eq.: Segnale NMR}) e sostituendo $N_\alpha - N_\beta$
dalla (\ref{Eq.: DeltaSpinNMR}) si ottiene che il segnale dipende dal quadrato del
campo magnetico applicato, ovvero raddoppiando l'intensità del campo magnetico si avranno
spettri 4 volte più definiti.
\begin{align}
	Segnale &\propto (B_0)^2
\end{align}

\subsection{Spostamento Chimico}
Finora abbiamo considerato tutti gli atomi di un determinato elemento come uguali.
Le potenzialità analitiche dell'NMR, però, dipendono proprio dal fatto che questa
tecnica consente di determinare la struttura chimica di un composto a partire dal
suo spettro.
Questo è possibile perché ogni atomo di una molecola (a meno di simmetrie o casuali
sovrapposizioni) presenta un segnale distinto.

\subsubsection{Campo magnetico locale}
Questo accade perché i fotoni della radiofrequenza interagiscono col nucleo ad una
frequenza che, come detto, dipende dal campo magnetico.
L'intorno chimico di un atomo, però, lo può caratterizzare come più elettronricco o
più elettronpovero e la nuvola di elettroni in movimento attorno al nucleo genera
un campo magnetico locale addizionale la cui intensità dipende dal campo magnetico
principale.
\begin{align}
	\delta B = -\sigma B_0
\end{align}

dove $\sigma$ è detta costante di schermatura.
Il campo magnetico locale ($loc$) è quindi pari a:
\begin{align}
	B_{loc} = B_0 (1-\sigma)
\end{align}

\subsubsection{Costante di spostamento chimico ($\delta$)}
Poiché $\sigma$ dipende da $B_0$ maggiore è l'intensità del campo magnetico principale
maggiore sarà lo spostamento chimico dell'atomo.
Per rendere confrontabili gli spettri NMR registrati a frequenze diverse, quindi, lo
spostamento chimico è stato definito per differenza rispetto ad uno standard: in questo
modo diventa un numero adimensionale, indipendente dallo strumento.
\begin{align}
	\delta_x = \frac{\nu_x - \nu^0}{\nu^0} \cdotp 10^6
\end{align}
dove $\nu^0$ è la frequenza dello standard (per l'\ce{^{1}H}-NMR in genere il tetrametilsilano,
abbreviato TMS (\ce{Si(CH3)4}\footnote{E' stato scelto il TMS in quanto può essere usato
sia nell'H che nella C-NMR, è simmetrico, da' un picco NMR intenso e stretto, i suoi protoni
sono più schermati di quasi tutti i protoni organici, è volatile (bolle a $27\celsius$),
inerte chimicamente e si scioglie prontamente in quasi tutti i liquidi.}.

Il fattore $10^6$ è arbitrario e rende giustizia della piccola entità degli spostamenti
chimici. E' quindi consuetudine indicare i valori di $\sigma$ aggiungendo l'indicazione
$ppm$ sebbene ciò non sia necessario.

Nota inoltre che i valori di spostamento chimico dipendono significativamente dall'atomo
considerato: ad esempio i valori dell' \ce{^{1}H}-NMR sono generalmente inferiori di un'ordine
di grandezza abbondante rispetto a quelli \ce{^{13}C}-NMR.

Dall'espressione di $\delta$ si nota che al diminuire di $\sigma$ aumenta $\delta$, ovvero
gli atomi con gli spostamenti chimici maggiori sono quelli più ``deschermati''.

\subsection{Accoppiamento spin-spin}
\label{NMR:spin-spin}
Nuclei che sono soggetti allo stesso intorno chimico sono chimicamente e magneticamente
equivalenti, e mostrano lo stesso spostamento chimico.
Nuclei non equivalenti tra loro vicini si influenzano con un effetto detto ``accoppiamento
spin-spin'' o J-coupling.

Nel caso più semplice due protoni legati a carboni adiacenti si influenzano l'un l'altro
con una \ce{^{3}J}, ovvero un accoppiamento lungo 3 legami, anche detto coupling
vicinale (\ce{H1}-\ce{C1}, \ce{C1}-\ce{C2}, \ce{C2}-\ce{H_2}).

Il coupling deriva dalla regola di Pauli per cui i due elettroni di un legame chimico
non possono che avere spin antiparallelo (ovvero opposto) tra loro.
In un campo magnetico c'è una certa tendenza da parte di un nucleo a seguire lo spin
del suo elettrone di legame.
In altre parole il livello energetico dello stato con spin alternati ne risulterà
abbassato e quello con spin uguale sarà più alto (vedi img.\ \ref{Fig.:NMR_Coupling_schema}).

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_coupling.png}
 % NMR_coupling.png: 945x726 pixel, 300dpi, 8.00x6.15 cm, bb=0 0 227 174
 \caption{Diagramma energetico di un sistema di spin accoppiati AX in H-NMR
	($\alpha$ è livello energetico minore).}
 \label{Fig.:NMR_Coupling_schema}
\end{figure}

Questo significa che, considerando un sistema di due protoni accoppiati aventi spostamenti
chimici molto diversi (simbolicamente AX), ogni segnale sarà sdoppiato a causa dell'effetto
del coupling (ovvero in funzione dello spin dell'atomo con cui accoppia) e la distanza
tra i picchi (la $J$) è proporzionale all'entità del coupling.

Nota che, nel diagramma in figura \ref{Fig.:NMR_Coupling_schema} sono permesse solo
le transizioni elementari, ovvero quelle che modificano uno spin per volta.

I sistemi accoppiati di ordine superiore seguono lo stesso principio e sistemi di
spin di primo ordine possono essere costruiti con la regola del triangolo di Pascal.

\section[Tecniche NMR]{Tecniche di registrazione del segnale}
\subsection{Onda continua (CW)}
Gli spettri acquisiti in onda continua \en{Current Wave - CW} sono importanti storicamente,
in quanto sono stati i primi esperimenti NMR effettuati, essendo la metodica più
semplice, ma risultano oggi superati dagli esperimenti di NMR ad impulsi.

In un esperimento CW il campione è posto in un campo magnetico costante e si varia
la frequenza di scansione (più comune), in alternativa si può mantenere la frequenza
d'irradiazione costante e variare il campo magnetico.
In entrambi i casi è misurato l'assorbimento della radiazione.

Quello che si ottiene è un diagramma bidimensionale con il segnale in
funzione della frequenza (nel caso si sia variato il campo magnetico se ne ottiene
matematicamente la frequenza corrispondente a campo magnetico fisso).
Possono essere così calcolati gli spostamenti chimici $\sigma$ e le costanti di
accoppiamento $J$.

\subsection{NMR ad impulsi}
In un esperimento ad impulsi, invece, il campione posto in un campo magnetico costante
è irradiato da un impulso radio ad alta energia con un intervallo di frequenze tale da
coprire tutto il campo d'interesse (durata di pochi \si{\micro \second}).
Questo impulso porta allo stato eccitato contemporaneamente tutti i nuclei.

\esame[11/1/12]{Illustrare le differenze tra un esperimento NMR ad onda continua ed uno
ad impulsi}
In pratica la differenza tra CW ed NMR pulsata è che, volendo trovare la nota di una
campana, nel primo caso si emettono una per volta tutte le frequenze fino a trovare
quella che la mette in risonanza, nel secondo si colpisce con un martello la campana
e si ascolta che suono emette. Inutile dire quale sia il sistema più rapido.

\subsubsection{Free Induction Decay (FID)}
Non appena viene meno l'impulso i nuclei ``tornano dallo stato eccitato al livello
energetico fondamentale, emettendo l'energia precedentemente assorbita come un
fotone con frequenza nel campo delle onde radio.
Il detector misura quindi questi segnali del cosiddetto FID \en{Free Induction Decay}.

Il FID, in questo caso, è composto dalla sovrapposizione di tutti i decadimenti in
funzione del tempo e può essere convertito ad un diagramma in funzione delle frequenze
attraverso la trasformata di Fourier.

\subsubsection{Pacchetti di spin}
Per una descrizione degli esperimenti di NMR-pulsata risulta utile introdurre il
concetto di pacchetto di spin o ``spin-packet''.

All'interno di un campione si possono definire dei ``pacchetti di spin'' come gruppi
di nuclei con $\approx$ lo stesso interno chimico, quindi lo stesso campo magnetico
locale e la stessa frequenza di Larmor.
Tali pacchetti avranno due popolazioni, una allo stato di spin eccitato ($N_\beta$
per il protone) e l'altra nello stato a più bassa eneriga ($N_\alpha$).

Posti in un campo magnetico $B_0$ gli spin si allineano al campo ($+$ o $-$) ma
è presente una differenza (che dipende dal rapporto giromagnetico) tra
le due popolazioni ($N_\alpha$-$N_\beta$) tale che la popolazione del pacchetto
di spin, nel complesso, può essere rappresentata da un vettore di magnetizzazione
globale $M_0$, che giace nella direzione del campo magnetico principale.

\subsubsection{Vettore di magnetizzazione}
L'ottenimento del vettore di magnetizzazione all'equilibrio come somma vettoriale
dei momenti magnetici dei singoli nuclei formanti il pacchetto è illustrato in figura
\ref{Fig.:NMR_M0_eq}

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_vettore_magnetizzazione.png}
 % NMR_vettore_magnetizzazione.png: 735x352 pixel, 96dpi, 19.44x9.31 cm, bb=0 0 551 264
 \caption{Vettore di magnetizzazione netta all'equilirio come somma vettoriale
	dei momenti magnetici dei nuclei del sistema di spin.}
 \label{Fig.:NMR_M0_eq}
\end{figure}

La lunghezza del vettore $M_0$ dipenderà dalla differenza tra le popolazioni di spin (che
a sua volta dipendeva dalla temperatura e dal campo magnetico secondo Boltzmann).

\subsubsection{Riferimento cartesiano xyz}
Per permettere una trattazione analitica è necessario introdurre un sistema di riferimento
cartesiano xyz.
la direzione z è quella del vettore di magnetizzazione e del campo magnetico principale
mentre x ed y sono fissi nello spazio fisico (in genere $x$ è l'asse della spira che
emette la radiofrequenza e che funge da detector).

Il vettore magnetizzazione $\vec M$ può quindi essere scomposto nelle componenti
scalari $M_x$, $M_y$ ed $M_z$, dove $M_x$ è detta magnetizzazione longitudinale, mentre
le componenti sul piano $xy$ sono dette magnetizzazione trasversale.

All'equilibrio $M_0$ presenta solo magnetizzazione longitudinale.

\subsubsection{L'effetto della radiofrequenza}
\label{subsec: effetto RF}
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=12cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_spin_lattice.png}
 % NMR_spin_lattice.png: 845x276 pixel, 96dpi, 22.35x7.30 cm, bb=0 0 634 207
 \caption{}
 \label{Fig.:NMR_Spin_lattice}
\end{figure}
Si consideri l'immagine \ref{Fig.:NMR_Spin_lattice}.
Lungo l'asse x è posta una spira che, quando attraversata dalla corrente elettrica,
genera un campo elettrico lungo l'asse x.
A quel campo elettrico corrisponde una componente magnetica, $B_1$, il cui effetto
sull'origine degli assi, ovvero sul campione sottoposto a NMR, può essere descritto
come un vettore magnetico rotante nel piano xy.

La frequenza della rotazione dipende dalla lunghezza d'onda dell'onda elettromagnetica
generata dalla spira, ed è pari alla frequenza di Larmor per il nucleo\footnote{In
realtà pacchetti di spin diversi hanno frequenze di Larmor lievemente diverse,
ma un segnale intenso e breve (\si{\micro \second}!) funziona lo stesso per quello
che è lo scopo dell'impulso, ovvero ``spostare'' il vettore $M$ sul piano $xy$ e farlo
ruotare con frequenza $\nu_L$}.
L'effetto di questo campo magnetico è quello di orientare il vettore di magnetizzazione
$M$ lungo il piano xy e metterlo in rotazione alla frequenza della radiofrequenza.

Ricordando l'immagine \ref{Fig.:NMR_nucleo_precessione} ciò è possibile perché i
singoli nuclei hanno un moto di precessione attorno all'asse z con frequenza $nu_L$.
Pertanto il vettore di magnetizzazione $B1$ appare loro fermo (o quasi-fermo se
tenendo conto delle piccole variazioni nelle $\nu_L$).
Il loro momento di dipolo (che può essere considerato come una calamita)
si orienterà quindi lungo $B_1$ sul piano xy, ma, al venir meno di $B_1$, tornerà
a precedere attorno a z per l'effetto di $B_0$.

\subsubsection[Rilassamento T1]{Tempo di rilassamento longitudinale $T_1$ (spin-lattice)}
$M_z$ torna all'equilibrio ($M_0$) secondo una costante temporale ($T_1$) detta
tempo di rilassamento longitudinale o tempo di rilassamento spin-lattice o
spin-reticolo\footnote{Questo nome deriva dal fatto che durante il processo è
ceduta energia al sistema circostante, detto ``reticolo'' \en{lattice}}.
\begin{align}
	M_z (t) - M_0 &\propto e^{-t/T_1} \\
	M_z &= M_0 \cdotp (1-e^{-t/T_1}) \label{Eq.: T1}
\end{align}

\subsubsection[Rilassamento T2]{Tempo di rilassamento trasversale $T_2$ (spin-spin)}
Dopo aver irradiato il campione con un impulso di frequenza $\nu_L$ si ha la rotazione
dei momenti di dipolo dei protoni con la stessa frequenza attorno all'asse z.
Col venir meno dello stimolo in radiofrequenza ogni pacchetto di spin torna a ruotare
con la propria frequenza di precessione che, avendo spostamenti chimici diversi,
è lievemente diversa.
Ciò provoca una progressiva perdita di fase rispetto al $\nu_L$.

Se si considera il vettore di magnetizzazione globale $M$ questa perdita di fase
può essere vista come una diminuzione della sua componente $xy$, ovvero come una
minor magnetizzazione trasversale.
L'andamento della perdita di magnetizzazione trasversale in funzione del tempo dipende
da una costante $T_2$ detta tempo di rilassamento trasversale o tempo di rilassamento
spin-spin.
\begin{align}
	M_{x,y} (t)  &\propto e^{-t/T_2} \\
	M_{x,y} &= M_{x,y}^{orig} \cdotp e^{-t/T_2} \label{Eq.: T2}
\end{align}


Il valore di $T_2$ è sempre minore (basse temperature/alta viscosità) o uguale (alta
temperatura/bassa viscosità) a $T_1$, ed è dell'ordine di grandezza di qualche secondo.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=5cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_T2_risoluzione.png}
 % NMR_T2_risoluzione.png: 591x683 pixel, 300dpi, 5.00x5.78 cm, bb=0 0 142 164
 \caption{Dipendenza della risoluzione dal $T_2$.}
 \label{Fig.:NMR_T2}
\end{figure}

L'immagine \ref{Fig.:NMR_T2} mostra la relazione tra potere risolutivo teorico dell'NMR
e $T_2$.

\subsubsection{Disomogeneità di campo}
Il $T_2$ teoricamente dipende solo dalle interazioni molecolari ($T_2$ puro).
In realtà, poiché i magneti impiegati per non sono perfetti ma presentano disomogeneità
di campo, il $T_2$ ne risulta più breve.

Questo $T_2$, detto tempo di rilassamentro trasversale effettivo ed indicato con $T_2^*$,
provoca un maggiore allargamento delle bande del segnale (cfr.\ fig.\  \ref{Fig.:NMR_T2}).
In particolare:
\begin{align}
	T_2^* &= \frac{1}{\pi \Delta \nu_{1/2}}
\end{align}
dove $\nu_{1/2}$ è l'allargamento previsto dal $T_2$ puro, pertanto:
\begin{align}
	T_2^* &= \frac{1}{T_{2 puro}} + \frac{1}{T_{2 disomog.}} 
\end{align}
Risulta, pertanto, cruciale diminuire il più possibile le disomogeneità del campo magnetico.

L'effetto del $T_2$ sulla risoluzione può anche essere spiegato in riferimento alla
trasformata di Fourier: essa trasforma il dominio del tempo in quello delle frequenze:
se ha a disposizione più punti nel tempo (e quindi se il rilassamento spin-spin
è più breve) darà risultati migliori nello spettro (cfr.\ fig.\ ).
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_T2_risoluzione_slide.png}
 % NMR_T2_risoluzione_slide.png: 642x418 pixel, 96dpi, 16.98x11.06 cm, bb=0 0 481 313
 \caption{Miglioramento della risoluzione corrispondente all'allungamento del $T_2$}
 \label{Fig.:NMR_T2_risoluzione2}
\end{figure}

\subsection{Omogeneità del campo magnetico}
Per produrre spettri ad alta risoluzione è necessario che il campo magnetico sia omogeneo
nello spazio e costante nel tempo.
Poichè l'NMR è uno strumento molto sensibile, ed i campi magnetici coinvolti sono
particolarmente intesi è facile che il movimento di oggetti metallici o altri fenomeni
incontrollabili alterino il campo magnetico.
Questo problema viene superato con il Field-Frequency Lock.

\subsubsection{Field Frequency Lock}
Il \emph{field frequency lock}, o, semplicemente, ``lock'' può essere considerato come
uno spettrometro NMR sperato dallo strumento principale ma accoppiato a quest'ultimo
per diminuirne le disomogeneità di campo.
Esso è generalmente sintonizzato sulla frequenza di risonanza del deuterio, che misura
in continuo operando minime variazioni in real-time su $B_0$ per mantenere costante la
frequenza di risonanza.

Il deuterio da' sempre un segnale forte in quanto viene impiegato al posto dei protoni
nei solventi NMR (es.\ \ce{CDCl3}) per evitare l'effetto del solvente nello spettro del protone.

\subsubsection{Shim colis}
Per annullare anche le disomogeneità locali nel campo magnetico principale, quelle quindi
che non possono essere annullate variandone l'intensità tout-court come fa il lock, si
utilizzando delle spire secondarie progettate per creare campi magnetici che si oppongano
alle disomogeneità locali, annullandole.

Queste spire secondarie sono dette ``shim coil'' e la corrente che le attraversa può
essere regolata in funzione dello spettro ottenuto al fine di avere il risultato migliore.

Poiché gli shim coil correggono le disomogeneità di campo vanno a diminuire il $T_{2 disomog.}$
allungando quindi il $T_2^*$ e la qualità del segnale prodotto dopo FT.

\subsubsection{Rotazione campione}
Un altro metodo per tentare di diminuire le disomogeneità è quello di ruotare il
campione durante l'analisi in modo che gli effetti di disomogeneità vengano mediati
e si ottengono spettri più definiti.

\subsection{Sistemi di riferimento rotanti}
Per semplificare la trattazione delle varie sequenze-NMR risulta estremamente utile
introdurre un sistema di riferimento rotante $x'y'z'$ avente $z' = z$ del riferimento
$xyz$ precedente, ovvero asse zeta longitudinale al campo magnetico principale, ma 
con il piano $x'y'$ ruotante alla frequenza di Larmor $\nu_L$.

In questo modo il vettore di magnetizzazione $B_1$ risulta stazionario nel nuovo
sistema di riferimento, mentre vettori più lenti di $\nu_L$ ruoteranno in senso
antiorario e vettori più veloci in senso orario.
In questo modo la trattazione del $T_2$ ne risulta estremamente semplificata come
illustrato in figura \ref{Fig.:NMR_T2_rotante}.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_T2_sist_rotante.png}
 % NMR_T2_sist_rotante.png: 822x283 pixel, 96dpi, 21.75x7.49 cm, bb=0 0 616 212
 \caption{Rapresentazione del tempo di rilassamento spin-spin nel sistema di riferimento rotante.}
 \label{Fig.:NMR_T2_rotante}
\end{figure}

\subsection[90-FID]{Sequenza 90-FID}
La sequenza illustrata nella sezione \ref{subsec: effetto RF} per spiegare $T_1$ e
$T_2$ è la cosiddetta 90-FID in quanto genera un FID  di durata $T_2^*$.

Le fasi per l'acquisizione di uno spettro con sequenza 90-FID sono illustrate in
figura \ref{Fig.:NMR_90FID}.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_90FID.png}
 % NMR_90FID.png: 759x395 pixel, 96dpi, 20.08x10.45 cm, bb=0 0 569 296
 \caption{Procedimento per l'ottenimento di uno spettro NMR con sequenza 90-FID.}
 \label{Fig.:NMR_90FID}
\end{figure}
Il passaggio (a) è l'applicazione dell'impulso a $90\degree$ ($\pi/2$ in radianti),
lo step (b) rappresenta il FID nel sistema $x'y'z'$ con $3$ sistemi di spin (L1, L2 ed L3)
(c) è il segnale in funzione del tempo trasformanto mediante trasformata di Fourier (d)
nello spettro in funzione delle frequenze.

\subsubsection{Rapporto segnale/rumore}
Per migliorare il rapporto segnale-rumore è possibile ripetere la sequenza numerose
vole e sommare i FID ottenuti per poi effettuare la FT sui risultati di più scansioni.

Prima di applicare il secondo impulso 90-FID, però, è necessario aspettare che tutti
i nuclei (o quasi) siano tornati allo stato di equilibrio.
L'ampiezza del segnale ($S$), infatti, dipende dal rapporto tra il tempo che intercorre
tra le ripetizioni ($T_R$) ed il tempo di rilassamento spin-lattice ($T1$).
\begin{align}
	S &= k \rho (1- e^{-T_R / T_1})
\end{align}
dove $\rho$ è la densità degli spin del campione e $k$ una costante.

In breve un campione con un $T_1$ più lungo richiedewrà un tempo più lungo tra
impulsi successivi.

\subsection{NMR bidimensionale}
\label{NMR-2D}
\emph{Nota Bene: in questa sezione si fa sempre riferimento ai sistemi di riferimento
ruotanti, anche quando non indicati con apici.}
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=4cm]{./img/NMR2D_Atk1.png}
 % NMR2D_Atk1.png: 259x458 pixel, 96dpi, 6.85x12.12 cm, bb=0 0 194 343
 \caption{Effetto del primo impulso a $90\degree$.}
 \label{Fig.:NMR2D_atk1}
\end{figure}

Nell'NMR bidimensionale viene sfruttata una doppia sequenza $90$-FID: il campione,
infatti, viene prima irraggiato con un canonico impulso a $90\degree$, e poi, ad una
distanza di tempo $t_1$ variabile, e comunque durante il decadimento conseguente al
primo impulso riceve un ulteriore sequenza a $90\degree$.

Il primo impulso a $90\degree$ ha l'effetto di spostare il vettore di magnetizzazione
netta nel piano xy dove ruoterà alla frequenza di Larmor mentre avvengono i rilassamenti
spin-spin e spin-lattice.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=4cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR2D_Atk2.png}
 % NMR2D_Atk2.png: 361x191 pixel, 96dpi, 9.55x5.05 cm, bb=0 0 271 143
 \caption{Situazione al tempo $t_1$.}
 \label{Fig.:NMR2D_atk2}
\end{figure}


A questo punto, mentre l'intensità della magnetizzazione trasversale diminuisce in funzione del
tempo secondo l'equazione (\ref{Eq.: T2}), i pacchetti di spin perdono progressivamente
fase rispetto alla frequenza di Larmor.
Dopo un tempo arbitrario $t_1$, detto periodo di evoluzione, si avrà una situazione
simile a quella rappresentata in figura \ref{Fig.:NMR2D_atk2}.
A questo punto viene inviato un altro impulso, sempre a $90\degree$ che ruota nuovamente
le componenti del vettore di magnetizzazione.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=4cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR2D_Atk3.png}
 % NMR2D_Atk3.png: 378x466 pixel, 96dpi, 10.00x12.33 cm, bb=0 0 283 349
 \caption{Effetto del secondo impulso a $90\degree$.}
 \label{Fig.:NMR2D_atk3}
\end{figure}

L'effetto di questo secondo impulso è rappresentanto in figura \ref{Fig.:NMR2D_atk3}.
La componente $x$ dei vettori è mantenuta sul piano $x,y$ mentre la componente $y$
viene ruotata sull'asse $z$ (dove non viene registrata).
Si misura quindi il FID prodotto da questo secondo impulso.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR2d_Silver1.png}
 % NMR2d_Silver1.png: 762x565 pixel, 96dpi, 20.16x14.95 cm, bb=0 0 571 424
 \caption{Processi per la creazione di uno spettro bidimensionale a partire da 22 spettri di acetone con $t_1$ crescente.}
 \label{Fig.:NMR2D_formazione_spettro}
\end{figure}

Il $t_1$ è come il tempo in un FID classico, e al variare del $t_1$ la proiezione
sull'asse $y$ di ogni sistema di spin varia con un andamento sinusoidale d'intensità
decrescente e che impiega per ogni rotazione il reciproco della propria frequenza,
e non più della frequenza di Larmor in quanto è venuta meno la radiofrequenza.
È proprio questo che causa il tempo di rilassamento $T_2$.
Si può notare, da questa osservazione, che il valore d'intensità variabile della proiezione y
di un picco al variare del tempo $t_1$ in un esperimento COSY fornisce un'ulteriore FID.
Dalla trasformata di Fourier di questo FID avente per dominio non direttamente il tempo ma la
successione di spettri a tempi diversi deriva la seconda dimensione dell'NMR-2D.

Possiamo applicare la considerazione di cui sopra ad ogni punto del FID ``classico''
trovato dopo $t_2$ per realizzare un grafico che può essere tridimensionale (\ref{Fig.:NMR2D_COSY_3D})
o bidimensionale con linee di contorno della proiezione di z (\ref{Fig.:NMR2D_COSY_isointensita})
a seconda del proprio gusto estetico.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR2D_piano_singolo_protone.png}
 % NMR2D_piano_singolo_protone.png: 375x208 pixel, 96dpi, 9.92x5.50 cm, bb=0 0 281 156
 \caption{Grafico tridimensionale rappresentante uno spettro COSY di un composto con un singolo
	protone, o con protoni magneticamente equivalenti.}
 \label{Fig.:NMR2D_COSY_3D}
\end{figure}

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR2D_iso_singolo_protone.png}
 % NMR2D_iso_singolo_protone.png: 187x184 pixel, 96dpi, 4.95x4.87 cm, bb=0 0 140 138
 \caption{Rappresentazione bidimensionale dello spettro COSY di figura \ref{Fig.:NMR2D_COSY_3D}.}
 \label{Fig.:NMR2D_COSY_isointensita}
\end{figure}

\subsection{Trasferimento della magnetizzazione}
Il trasferimento della magnetizzazione è il fenomeno più utile a fini diagnostici 
e più sfruttato dagli esperimenti di NMR bidimensionale attuali.
Mediante opportune sequenze d'impulsi, infatti, è possibile spostare la magnetizzazione
da un nucleo ad un altro.
Esistono due possibili modi in cui può essere trasferita la magnetizzazione:
\begin{itemize}
    \item l'effetto di Nuclear Overhauser (NOE);
    \item INEPT.
\end{itemize}

\subsubsection[NOE]{Nuclear Overhauser Effect (NOE)}
L'effetto NOE è un trasferimento di magnetizzazione che avviene nello spazio.
Poiché decade con l'inverso della sesta potenza della distanza permette di individuare
protoni distanti fino a $0,5\si{\nano \meter}$.
L'effetto NOE è molto utile per determinare la conformazione spaziale assunta da
molecole complesse, es.\ proteine, in quanto permette di rilevare come vicini anche
atomi che appartengono a sistemi di spin diversi.

Per fare ciò si irradia, come negli esperimenti di doppia risonanza, la frequenza
corrispondente ad un protone.
Generalmente si fa questo per ``cancellare'' il protone ed i suoi accoppiamenti in
uno spettro monodimensionale, per semplificarlo.
Nel caso di un esperimento \ce{{1}^H}-\ce{{1}^H}-NOE (esperimento molto raro in verità,
ma utile per questa spiegazione teorica) si procede allo stesso modo, ovvero si irradia
un protone ma con intensità molto minore rispetto a quella usata per il decoupling.
I protoni vicini nello spazio rispetto a quello irradiato subiranno l'effetto NOE,
sia che siano accoppiati col protone irradiato, sia che non lo siano.

La polarizzazione del nucleo irradiato (che è la variazione di popolazione nei livelli
energetici) risulta, nello spazio, in un'accresciuta popolazione dei livelli energetici
superiori dei nuclei (non irradiati!) vicini nello spazio.
Questo eccesso di popolazione $N_\beta$ ha un rilassamento spin-lattice maggiore
(l'$M_z$ dei pacchetti di spin che hanno subito il NOE va ``più in basso'').
E' per questo che l'effetto NOE è anche detto ``trasferimento della magnetizzazione z''.
Questa variazione al vettore di magnetizzazione longitudinale incrementa il segnale
dei protoni vicini nello spazio rispetto all'irradiato per effetto NOE.
La differenza d'intensità è minima, generalmente minore al $20\%$, ma se si osserva
lo spettro per sottrazione di uno spettro classico si ottengono tutte e sole le informazioni
di NOE.
Un esempio di spettro \ce{{1}^H}-NOE è mostrato in figura \ref{Fig.:NMR_NOE_H}.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_NOE_H.png}
 % NMR_NOE_H.png: 784x360 pixel, 96dpi, 20.74x9.52 cm, bb=0 0 588 270
 \caption{In figura sono riportati tre spettri per il composto raffigurato.
	Il primo (c) è uno spettro classico dove i picchi dei protoni singoli
	sono stati aumentati di 4 volte per avere altezza simile a quella dei \ce{CH3} terminali.
	Nel secondo (b) è irradiato il metile in 3 e si nota l'effetto NOE (segnale incrementato
	di 128 volte) sul protone in 4.
	Nel terzo spettro (c) è irradiato il metile in 5 e si vede la vicinanza spaziale con
	i protoni in 4 e 6.}
 \label{Fig.:NMR_NOE_H}
\end{figure}

\subsubsection[INEPT]{Trasferimento della coerenza (INEPT)}
Il trasferimento INEPT avviene attraverso i gli accoppiamenti J, ovvero tra nuclei
separati da 2,3 o pochi più legami.
Così come il NOE l'INEPT si applica sia ai nuclei di carbonio sia ai protoni, e come
il NOE può essere sia 1D (DEPT) sia 2D (COSY, HETCOR, HSQC, HMBC etc).

Si consideri un doppietto, es.\ in un sistema \ce{A2B} B sarà un doppietto con segnali
a $\nu + \frac{J}{2}$ e $\nu - \frac{J}{2}$ (cfr.\ fig.\ \ref{Fig.:NMR_INEP_schema}).
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics{./img/NMR_INEPT_schema.png}
 % NMR_INEPT_schema.png: 215x382 pixel, 96dpi, 5.69x10.11 cm, bb=0 0 161 286
 \caption{Diagramma di un nucleo con J-coupling.
	Si hanno due sistemi di spin distinti che avranno rilassamento spin-spin diverso.}
 \label{Fig.:NMR_INEP_schema}
\end{figure}

\paragraph{Antifase}
Dopo un impulso 90-FID i due sistemi di spin avranno rilassamento spin-spin diverso, in base
alla loro frequenza.
In particolare dopo un tempo $1 /(2 \cdotp J)$ avranno fase opposta.

Ricorda infatti che le $J$ si esprimono in \si{\hertz} che sono secondi alla meno uno (\si{\per \second})
e che un nucleo avente frequenza $\nu_1$ significa che ruota attorno all'asse zeta
con quella frequenza, ovvero compie una rotazione in $ 1 / \nu_1$ secondi.
Allo stesso modo due frequenze $\nu_1$ e $\nu_2$ diverse di $J$ che siano in fase
al tempo $t=0$ (ovvero alla sequenza 90-FID) saranno nuovamente in fase tra loro
dopo $1/J$ secondi e saranno in antifase a $1/2 \cdotp 1/J$.

Quando due momenti magnetici che accoppiano (ovvero tra i quali esista un J-coupling
lungo i legami chimici, cfr.\ sez.\ \ref{NMR:spin-spin}) sono in antifase il secondo
impulso 90-FID fa sì che la magnetizzazione si trasferisca da un atomo all'altro,
mantenendo la fase tra i due picchi.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=10cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_INEPT_transf.png}
 % NMR_INEPT_transf.png: 905x439 pixel, 96dpi, 23.94x11.61 cm, bb=0 0 679 329
 \caption{Trasferimento di fase in un sistema accoppiato AX.}
 \label{Fig.:NMR_INEPT_transf_fase}
\end{figure}

Si consideri l'immagine \ref{Fig.:NMR_INEPT_transf_fase} riferita ad un sistema di spin
AX dove i grafici della prima riga si riferiscono ad A e quelli della seconda riga ad
X. Entrambi i sistemi di spin sono costituiti da un doppietto.

Quando il primo sistema di spin è in antifase l'impulso 90FID ne trasferisce la magnetizzazione
al secondo sistema di spin.

\paragraph{Crosspeaks}
Quando invece i due momenti sono in fase (ai tempi multipli di $1/J$) non c'è trasferimento
di magnetizzazione.
Poiché possiamo rappresentare l'andamento del rapporto di fase tra i picchi di un
multipletto nel tempo un con andamento sinusoidale ($0\degree$-> in fase, $180\degree$ antifase etc.)
si ha che al variare del tempo $t_1$ si avrà un trasferimento di magnetizzazione variabile.

Questa intensità variabile genera un FID che alla frequenza sistema di spin del nucleo X
sarà di frequenza pari al sistema di spin del nucleo A e viceversa.
In altre parole si creano i caratteristici crosspeaks di correlazione bidimensionale COSY.

\subsection{Sequenze di correlazione}
\subsubsection[COSY]{COrrelation SpettroscopY (COSY)}
\esame[21/2/11]{Illustrare il processo di trasferimento della magnetizzazione e
la sua applicazione all'esperimento COSY}
La spettroscopia di correlazione (COSY) è una tecnica bidimensionale che sfrutta l'INEPT,
ovvero il trasferimento di magnetizzazione mediante J-coupling, per creare spettri
bidimensionali in cui sono evidenziate le correlazioni tra sistemi di spin che accoppiano.

Alla famiglia delle COSY appartengono diverse sequenze (COSY classica, è il doppio 90-FID
della sezione \ref{NMR-2D}, DQF-COSY, o COSY Double Quantum Filtered che pulisce
il segnale rimuovendo le correlazioni con i singoletti, es i metili, COSY-b, COSY-90 etc.).

Tutte le tecniche COSY però si basano sulla correlazione di protoni accoppiati tra 2,3
(o, eventualmente, più) legami secondo lo schema di figura \ref{Fig.:NMR_COSY_Schema}.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=6cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_COSY_schema.png}
 % NMR_COSY_schema.png: 205x178 pixel, 96dpi, 5.42x4.71 cm, bb=0 0 154 133
 \caption{Schema del trasferimento di magnetizzazione in un esperimento COSY.}
 \label{Fig.:NMR_COSY_Schema}
\end{figure}

\esame[2/5/11]{NMR-2D: Illustrare la sequenza $90\degree$-$t_1$-$90\degree$-$t_2$.
Descrivere lo spettro 2D-COSY del cloroetano.}
Dove (1.) è la radiazione $h\nu_L$ che mette in risonanza il primo protone, cui
segue (2.) un periodo di evoluzione $t_1$ dopo il quale il secondo impulso provoca il
trasferimento di magnetizzazione (3.) verso il secondo protone che viene quindi
registrato come crosspeak dal FID al $t_2$ (4.).

\subsubsection[HETCOR]{HETeronuclear chemical shift CORrelation (HETCOR)}
L'HETCOR è un esempio di NMR di correlazione eteronucleare, ovvero tra nuclei ``diversi'',
in questo caso, tipicamente, idrogeno e carbonio sfruttando la \ce{{1}^J_{CH}}.

In questo caso essendo i domini delle frequenze $nu_1$ e $\nu_2$ diversi (perché
si tratta di nuclei diversi) non si ha alcun appaiamento sulla diagonale.

La sequenza HETCOR è riportata in figura \ref{Fig.:NMR_HETCOR_seq}
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_HETCOR_sequenza.png}
 % NMR_HETCOR_sequenza.png: 342x204 pixel, 96dpi, 9.05x5.40 cm, bb=0 0 256 153
 \caption{Sequenza di un esperimento HETCOR.}
 \label{Fig.:NMR_HETCOR_seq}
\end{figure}

\subsubsection[2D-TOCSY]{2D TOtal Correlation SpettroscopY (TOCSY)}
La TOCSY è una sequenza analoga alla COSY in cui al posto del secondo impulso 90-FID
è inserito un ``mixing period'' formato da numerosi impulsi e durante il quale la
magnetizzazione viene trasferita più volte.
In questo modo è possibile osservare anche accoppiamenti a lunga distanza
(\ce{{4}^J}, \ce{{5}^J} etc).
La dipendenza della quantità di accoppiamenti visibili in funzione del mixing time
è evidente in figura \ref{Fig.:NMR_TOCSY_mixing_p} con lo spettro del $\beta$-lattosio.
$400\si{\ms}$ è il massimo tempo impostabile  per il mixing period e permetto in
questo caso di individuare tutti i protoni di un'unità saccaridica.
\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_TOCSY_mixing_time.png}
 % NMR_TOCSY_mixing_time.png: 789x539 pixel, 96dpi, 20.87x14.26 cm, bb=0 0 592 404
 \caption{Dipendenza del numero di coupling visibili in funzione del mixing period.}
 \label{Fig.:NMR_TOCSY_mixing_p}
\end{figure}

\subsection[HMBC]{Heteronuclear Multiple Bond Coherence}
L'HMBC è una sequenza eteronucleare al pari della HETCOR ma se la HETCOR misurava il FID
sui carboni la HMBC, all'opposto, lo registra sui protoni.
Per ragioni di intensità del segnale derivanti da abbondanza naturale e costante giroscopica
risulta evidente il vantaggio di tale tecnica sulla più datata HETCOR.\\
\textit{La maggiore risoluzione dell'HMBC sull'HETCOR è evidente se si confrontano gli spettri
HETCOR ed HMBC per l'ipsenolo nel quinto capitolo del Silverstein.}

\subsection[ROESY]{Rotating-frame Overhauser Effect SpettroscopY}
La ROESY è una sequenza NMR di correlazione bidimensionale omonucleare (protone-protone)
che sfrutta il trasferimento della magnetizzazione secondo l'effetto NOE.
Rispetto alla NOESY presenta il vantaggio di essere applicabile anche a piccole
molecole.

Rispetto alle COSY la ROSY presenta tutti gli stessi picchi, e talvolta anche alcuni
picchi TOCSY, cui si aggiungono però gli accoppiamenti per NOE.
In figura \ref{Fig.:NMR_VGSE} sono riportati gli spettri COSY, TOCSY e ROESY per
il tetrapeptide VGSE.
Sono evidenziati i segnali presenti solo nel ROESY che indicano la vicinanza spaziale
tra il protone ammidico della serina ed i protoni G2 della glicina, la relazione
tra il protone ammidico del glutammato ed i protoni in 2 e 3 della serina ed infine
l'interazione tra il protone ammidico della glicina ed il protone in 2 alla valina.

\begin{figure}[htb]
 \centering
 \includegraphics[width=8cm,keepaspectratio=true]{./img/NMR_vgse_roesy.png}
 % NMR_vgse_roesy.png: 654x467 pixel, 96dpi, 17.30x12.35 cm, bb=0 0 490 350
 \caption{Confronto COSY, TOCSY e ROESY sul tetrapeptide.}
 \label{Fig.:NMR_VGSE}
\end{figure}

\appendix
\addcontentsline{toc}{section}{Licenza per Documentazione Libera GNU}
%\chapter{Licenza per Documentazione Libera GNU}
\includepdf[pages=1-10]{fdl.pdf}

\setcounter{tocdepth}{3}
\tableofcontents
\end{document}